本协议描述了一个微加工兼容的方法在SiO 2细胞图案。预定义聚对二甲苯-C设计光刻印刷在SiO 2晶片。温育后用血清(或其它活化溶液)细胞粘附具体地(和根据的符合性生长)相关的聚对二甲苯-C,而被排斥由SiO 2区。
细胞图案平台支持广泛的研究目标,如建设预定义的体外神经网络和细胞生理学的某些主要方面的探索。要轻松地结合细胞图案用多电极阵列(MEA)和技术的硅基'在一个芯片上的实验室“,进行精微兼容协议是必需的。我们描述了利用了在SiO 2晶片的聚合物聚对二甲苯-C沉积的方法。光刻使的聚对二甲苯-C精确和可靠的图案在微米级的分辨率。通过浸渍在胎牛血清(或另一特定活化溶液)中的衬底的结果,其中培养的细胞粘附,或由聚对二甲苯或SiO 2区分别被击退后续激活。这种技术允许范围广泛的细胞类型(包括主要鼠海马细胞,HEK 293细胞系,人类神经元样畸胎的图案细胞系,原代鼠小脑颗粒细胞和原代人脑胶质瘤衍生的干细胞样细胞)。然而有趣的是,该平台是不通用的,反映了细胞特异性粘附分子的重要性。此细胞图案化工艺是成本有效的,可靠的,并且重要的是可结合到标准的微细加工(芯片制造)协议,集成微电子技术铺平了道路。
可以理解,听写细胞粘附和形成图案的合成材料的机制是用于诸如组织工程,药物发现和生物传感器1-3的制造中很重要的。许多技术可用,演变,影响细胞粘附的无数生物,化学和物理因素的每次服用的优势。
在这里,我们描述了一个,利用微电子制造的目的最初开发过程中的细胞图案化技术。因此,该平台是占尽天时地利,使微电子技术,如多边环境协定下游一体化,进入图形化平台。
细胞膜和相邻材料之间的界面是双向的和复杂的。 在体内 ,胞外基质蛋白提供结构和强度,并通过与细胞粘附受体的相互作用在细胞行为的影响。同样,细胞v中ITRO与合成底物通过蛋白4的吸收的层相互作用而物理-化学影响也调节粘合力。例如,聚合物表面可以呈现更多的“润湿”(亲水的)通过离子或紫外线照射,或蚀刻用酸或氢氧化5治疗。用于细胞图案建立的方法利用这些和其他细胞粘附介质。例子包括喷墨印刷6,微接触压印7,物理固定8,微流体9,实时操作10,和选择性的分子组装形成图案(SMAP)11。每个人都有特定的优点和局限性。在我们工作的一个关键驱动因素,但是,是细胞图案集成微机电系统(MEMS)。
微机电系统是指由电力驱动的非常小的机械装置。这与纳米相当于nanoelectromech重叠anical系统。这个概念变成了现实,只有当半导体的策略使制造要发生在微尺度。半导体电子独自开发的微细加工技术已在不经意间被发现的其他用途,如细胞电很有用,例如。一个关键的下游目标是这样的微电子技术,具有高的保真度细胞图案化工艺(形成微机电装置)结合。几个现有的及以其他方式可靠,实用的细胞图案化技术是这种想法不兼容。例如,任意的嵌入式微电子学或生物传感器的精确对齐是至关重要的它们的功效,但极难实现使用技术如微接触压印。
为了解决这个问题,我们正在使用光刻印刷聚对二甲苯-C的SiO 2为基础的图形平台。光刻涉及的几何特征从转让掩模,通过紫外线照射的基片。蒙版是使用适当的计算机辅助设计程序设计。后的玻璃板上,薄薄的一层不透明的铬的代表所需的几何图案(1-2毫米的特征分辨率是可能的)。要形成图案的基板上涂有一薄层光阻剂(紫外线敏感的聚合物)。涂覆的聚合物然后对准并使其与掩模紧密接触。可以用紫外线源被应用,使得未受保护的区域进行照射,因此变得可溶并可除去在接下来的显影步骤,使掩模图案的聚对亚二甲苯-C表示后面。这个过程起源的半导体器件的开发期间。因此,硅晶片被频繁用作基板。的聚对二甲苯-C在SiO 2光刻沉积,因此是一个简单而可靠的过程,通常发生在微电子洁净室设施。
虽然聚对二甲苯有几个理想的生物工程特性(化学惰性,非生物降解的),一个限制其在细胞图案直接使用的因素是其天生的穷细胞的粘附性,部分归因于它的极端疏水性。然而,聚对二甲苯-C先前已经间接地用于细胞图案化,例如作为可剥离的蜂窝模板12,13。这种方法是通过分辨率差的限制,需要多个步骤。这里所描述的过程,而不是利用酸蚀刻步骤,随后血清孵育,以确保聚对二甲苯-C的区域成为细胞粘接性,通过降低疏水性和血清蛋白结合的结合。
最终的结果是一个两个不同基材其中,生物活化后,表现出各自的细胞质粘性或细胞质-斥力等特性代表一个有效的细胞图案化平台组成的构建体。重要的是,没有必要引入生物股份公司ENTS进入无尘室设施作为图案化衬底可被存储为使用无限期之前(于是他们正在使用的胎牛血清或另一个激活溶液激活)。
因此,本parylene-C/SiO 2图案平台是一个很好的候选人与MEMS元件的联盟,因为制造工艺如此密切反映那些用于微电子制造。
芯片在食人鱼酸浸不仅用于除去任何残余的有机材料,但也蚀刻在衬底表面上。这是关键,为了能够有效地激活胎牛血清。如果不这样做可防止细胞图案化和深刻地改变芯片上细胞的行为。有没有要求清洗与食人鱼酸后消毒芯片。确实杀菌的紫外线照射已显示出削弱以剂量依赖的方式13细胞图案。必须注意的光刻工艺后洗掉所有的残余光致抗蚀剂。坚持光刻胶可以充当覆盖图案由parylene-C/SiO 2的几何形状决定的不必要的细胞质粘合层。使用上面,并与规定的试剂中所述的光刻工艺时,丙酮是有效的。然而,其他类型的光致抗蚀剂可能需要不同的溶剂中进行。
评估differe的影响,并成功nt的制造步骤中,有两种截然不同的基板的接触角可以被测量。 图2示出在芯片激活过程中发生的改变。这是有可能的,但是,在特定的血清粘合剂和排斥力蛋白质组分最终使聚对二甲苯图案芯片以发挥其各自的细胞质粘性或细胞质推斥特性。
所有代表性的成果使用的芯片为100 nm的聚对二甲苯厚度,尽管我们已经同时使用较厚和较薄的聚对二甲苯层成功地图案。重要的是,这种光刻技术允许的聚对二甲苯配置更大的三维控制比这里的说明。例如,在使用光掩模的组合,它可以创建混合厚度的聚对二甲苯的区域。这将打开的方式与定义的三维地形生成的细胞培养,超越的细胞粘附/斥力简单地发号施令地区锡永,潜在地提供集成的微流体通道到所述构建的一种手段。
如图所示,但是,该图案化平台不是普遍横跨细胞类型有效。不同的细胞系,与他们不同的细胞粘附分子型材,勿庸置疑有不同的行为在这个平台上培养时。我们还没有发现血清中的关键部件,也没有免费的细胞膜受体,它巩固这种细胞图案化平台。在未来这样做的承诺,以扩大其实用性和特异性。例如,一个“非图案化”的细胞系可被遗传修饰,以表达所需的粘附分子,因此促进形成图案。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由威康信托临床博士研究生奖学金(ECAT)的支持。
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |