يصف هذا البروتوكول على طريقة التصنيع الدقيق تتلاءم مع الزخرفة الخلية على شافي 2. يتم طباعة المعرفة مسبقا تصميم parylene-C photolithographically على شافي 2 رقائق. بعد الحضانة مع المصل (أو حل التنشيط الأخرى) الالتزام الخلايا على وجه التحديد (وتنمو وفقا لمطابقة) الكامنة parylene-C، في حين يجري صدت من قبل شافي 2 المناطق.
منصات الزخرفة خلية دعم أهداف البحث واسعة النطاق، مثل بناء المعرفة مسبقا الشبكات العصبية في المختبر واستكشاف بعض الجوانب المركزية في الفيزيولوجيا الخلوية. الجمع بين الزخرفة بسهولة مع خلية متعدد الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) والقائمة على السيليكون "مختبر على رقاقة" التكنولوجيات، لا بد من بروتوكول التصنيع الدقيق متوافق. نحن تصف طريقة التي تستخدم ترسب البوليمر parylene-C على شافي 2 رقائق. ضوئيه تمكن الزخرفة دقيقة وموثوق بها من parylene-C في القرار على مستوى ميكرون. التنشيط اللاحقة عن طريق الغمر في المصل الجنين البقري (أو الحل تفعيل محددة أخرى) النتائج في الركيزة التي الخلايا المستزرعة الالتزام، أو صد من قبل، أو parylene شافي 2 المناطق التوالي. وقد سمحت هذه التقنية الزخرفة من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا (بما في ذلك الخلايا الأولية الفئران الحصين، كلوة الجنين البشري 293 خط الخلية، مثل الخلايا العصبية البشرية سرطانة مسخيةخط الخلية، والخلايا الحبيبية للدماغ الفئران الأولية، والخلايا الجذعية مثل المستمدة دبقي الإنسان الأساسية). ومن المثير للاهتمام، ولكن، ومنصة ليست عالمية، مما يعكس أهمية خلية محددة جزيئات الالتصاق. وتكلف هذه العملية الزخرفة الخلية فعالة وموثوق بها، والأهم يمكن إدراجها في التصنيع الدقيق القياسية (تصنيع الرقائق) البروتوكولات، مما يمهد الطريق لدمج التكنولوجيا الدقيقة.
فهم الآليات التي تملي التصاق الخلية والزخرفة على المواد الاصطناعية المهم لتطبيقات مثل هندسة الأنسجة، واكتشاف المخدرات، وتصنيع أجهزة الاستشعار 1-3. تتوفر العديد من التقنيات المتطورة و، كل ميزة أخذ العوامل البيولوجية والكيميائية، والفيزيائية التي تؤثر على عدد لا يحصى التصاق الخلية.
هنا، نحن تصف تقنية خلية الزخرفة التي تستخدم العمليات التي وضعت في البداية لأغراض تصنيع الإلكترونيات الدقيقة. على هذا النحو، النظام الأساسي هو وضع جيد لتمكين التكامل المصب التكنولوجيات الدقيقة، مثل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، إلى منصة الزخرفة.
واجهة بين غشاء الخلية ومادة المجاورة هي ثنائية الاتجاه ومعقدة. في الجسم الحي، والبروتينات المصفوفة خارج الخلية توفير بنية وقوة وتأثير على سلوك الخلية عن طريق التفاعل مع مستقبلات التصاق الخلية. وبالمثل، الخلايا في الخامسitro التفاعل مع ركائز الاصطناعية عبر طبقات امتصاص البروتينات 4 بينما التأثيرات الفيزيائية والكيميائية أيضا تعدل التصاق. على سبيل المثال، سطح البوليمر يمكن تقديم المزيد "قابل للبلل" (ماء) عن طريق الأيونات أو الأشعة فوق البنفسجية التشعيع، أو الحفر عن طريق العلاج مع حمض أو هيدروكسيد 5. أساليب الزخرفة التي أنشئت لخلية الاستفادة من هذه وغيرها من الوسطاء التصاق الخلية. وتشمل الأمثلة الطباعة النافثة للحبر 6، 7 microcontact ختم، الشلل الجسدي 8، 9 على microfluidics، في الوقت الحقيقي التلاعب 10، وانتقائية الزخرفة التجمع الجزيئي (SMAP) 11. كل له فوائد وقيود محددة. سائق أساسي في عملنا، ومع ذلك، هو دمج الزخرفة الخلية مع أنظمة ميكانيكية إلكترونية صغيرة (ممس).
ممس الرجوع إلى الأجهزة الميكانيكية الصغيرة جدا مدفوعا الكهرباء. هذا يتداخل مع المقياس النانوي ما يعادلها، nanoelectromechنظم anical. أصبح هذا المفهوم العملي الوحيد عندما استراتيجيات تمكين أشباه الموصلات تلفيق عقده في microscale. ودون قصد وجدت تقنيات التصنيع الدقيق وضعت أصلا للإلكترونيات أشباه الموصلات مفيدة لاستخدامات أخرى مثل الكهربية الخلوية، على سبيل المثال. ومن الأهداف الرئيسية المصب هو الجمع بين هذه التكنولوجيات الدقيقة مع عملية الزخرفة الخلية عالية الدقة (تشكيل الجهاز bioMEMS). عدة تقنيات الخلية الزخرفة الموجودة وموثوق بها وإلا والعملية تتعارض مع هذه الفكرة. على سبيل المثال، والمحاذاة دقيقة من أي الالكترونيات الدقيقة جزءا لا يتجزأ من أجهزة الاستشعار أو أمر أساسي لفعاليتها ولكن من الصعب للغاية تحقيق باستخدام تقنية مثل microcontact ختم.
للتحايل على هذه المشكلة، ونحن نعمل على منصة الزخرفة شافي 2 المستندة يستخدم المطبوعة photolithographically parylene-C. ضوئيه ينطوي على نقل الميزات الهندسية منقناع لركيزة عبر الإضاءة فوق البنفسجية. تم تصميم قناع باستخدام البرنامج المناسب التصميم بمساعدة الكمبيوتر. على طبق من زجاج، طبقة رقيقة من الكروم غير الشفافة يمثل نمط هندسي المطلوب (قرار ميزة من 1-2 ملم هو ممكن). وهي مغلفة الركيزة لتكون منقوشة مع طبقة رقيقة من مقاومة للضوء (البوليمر حساسة للأشعة فوق البنفسجية). ثم يتم محاذاة البوليمر المغلفة وتقديمهم في اتصال وثيق مع القناع. يتم تطبيق مصدر الأشعة فوق البنفسجية بحيث مناطق غير محمية والمشع وبالتالي تصبح قابلة للذوبان وقابل للنقل في الخطوة القادمة التنمية، وترك التمثيل parylene-C من النمط قناع وراء. هذه العملية نشأت خلال تطوير أجهزة أشباه الموصلات. على هذا النحو، وكثيرا ما تستخدم رقائق السليكون باعتبارها الركيزة. ترسب الطباعة التصويرية من parylene-C على شافي 2 هو بالتالي عملية بسيطة وموثوق بها التي تأخذ عادة مكان في مرافق غرف الأبحاث الدقيقة.
في حين parylene ديهالعديد من الخصائص الهندسة الحيوية مرغوب فيه (خامل كيميائيا، غير قابلة للتحلل الحيوي)، وهو عامل تقييد استخدامه مباشرة في الزخرفة الخلية الفقراء بالفطرة الإلتصاق الخلية، يعزى في جزء منه إلى للا مائية المتطرفة. ومع ذلك، فقد سبق استخدامها parylene-C بشكل غير مباشر عن الزخرفة الخلية، على سبيل المثال باعتبارها قشر بعيدا قالب الخلوية 12،13. وهذا النهج محدودة بسبب ضعف القرار، ويتطلب خطوات متعددة. عملية وصفها هنا بدلا من ذلك يستخدم خطوة حفر الحامض، تليها الحضانة المصل، لضمان أن المناطق parylene-C تصبح خلية لاصق، من خلال مزيج من خفض للا مائية ومصل البروتين ملزمة.
والنتيجة النهائية هي بناء تتألف من اثنين من ركائز مختلفة والتي، بعد تفعيل البيولوجية، تظهر خصائص خلوي لاصقة أو خلوي للاشمئزاز منها، ويمثل منصة فعالة كلام بسرعة خلية بذلك. الأهم من ذلك، ليست هناك حاجة لإدخال AG البيولوجيةالوالدان في مرفق غرف الأبحاث باعتبارها ركائز منقوشة يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى قبل استخدامها (وعندها يتم تنشيطها باستخدام مصل بقري جنيني أو حل التنشيط أخرى).
وبالتالي هذا المنبر الزخرفة parylene-C/SiO 2 هو مرشح جيد لتشكيل ائتلاف مع مكونات ممس، وعمليات التصنيع بحيث تعكس عن كثب تلك المستخدمة لتصنيع الإلكترونيات الدقيقة.
الغمر من رقائق في حمض سمكة البيرانا لا يخدم فقط لإزالة أي المواد العضوية المتبقية ولكن أيضا يحفر السطوح الركيزة. هذا هو المفتاح لتمكين التنشيط الفعال مع مصل بقري جنيني. عدم القيام بذلك يمنع خلايا الزخرفة وعميقا يغير سلوك الخلية على رقاقة. ليس هناك شرط لتعقيم رقائق بعد التنظيف مع حمض سمكة البيرانا. في الواقع التعقيم بواسطة الأشعة فوق البنفسجية التعرض وقد تبين لتقويض الزخرفة خلية في الأزياء تعتمد على الجرعة 13. يجب توخي الحذر ليغسل كل مقاوم الضوء المتبقية بعد عملية الطباعة بصفائح معدة ضوئيا. استمرار مقاومة للضوء يمكن أن تكون بمثابة طبقة لاصقة خلوي غير المرغوب فيها التي يتجاوز الزخرفة التي تمليها parylene-C/SiO 2 الهندسة. الأسيتون فعالة عند استخدام عملية الطباعة التصويرية المذكورة أعلاه ومع الكواشف محددة. ومع ذلك، وأنواع أخرى من مقاومة للضوء قد تتطلب المذيبات المختلفة.
لتقييم تأثير ونجاح احالإقليم الشمالي خطوات التصنيع، ويمكن قياس زاوية الاتصال من اثنين من ركائز المتناقضة. ويوضح الشكل (2) والتعديلات التي تحدث أثناء عملية التنشيط رقاقة. فمن المرجح، مع ذلك، أنه لاصقة معينة ومكونات البروتين مثير للاشمئزاز في مصل الدم في نهاية المطاف تمكين رقاقة نقوش parylene لممارسة خصائص خلوي لاصقة أو خلوي للاشمئزاز منها لها.
جميع النتائج ممثل تستخدم رقائق بسمك parylene من 100 نانومتر، على الرغم من أننا قد منقوشة بنجاح باستخدام كل سمكا وأرق طبقات parylene. الأهم من ذلك، هذه التقنية الحفر الطباعة التصويرية يسمح سيطرة أكبر بكثير ثلاثية الأبعاد من التكوين parylene من ذلك يتضح هنا. على سبيل المثال، باستخدام مزيج من photomasks، فمن الممكن لخلق مناطق parylene من سمك مختلطة. هذا يفتح الطريق أمام إنشاء مزارع الخلايا مع تعريف تضاريس ثلاثية الأبعاد، تتجاوز مجرد إملاء من مناطق التصاق الخلية / repulسيون، ويحتمل أن تقدم وسيلة لدمج قنوات ميكروفلويديك في بناء.
كما هو مبين، ولكن هذا ليس الزخرفة منصة فعالة عالميا عبر أنواع الخلايا. خطوط مختلفة من الخلايا، مع لمحات متنوعة التصاق الخلية الجزيء، وتتصرف بشكل مختلف لا يثير الدهشة عندما مثقف على هذه المنصة. نحن لم تتعرف بعد على المكونات الرئيسية في المصل، ولا مستقبلات خلايا الغشاء مجانية، والتي تدعم هذه المنصة خلية الزخرفة. القيام بذلك في المستقبل وعود لتوسيع فائدته وخصوصية. على سبيل المثال، "غير الزخرفة 'خط خلية يمكن تعديلها وراثيا في التعبير عن جزيء التصاق المطلوبة وذلك تشجيع الزخرفة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل ويلكوم ترست الدكتوراه السريرية الزمالة (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |