성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식
Summary
세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.
Abstract
망막의 빛 감지 세포, 즉 광수용체의 손실로 인한 시력 장애 및 실명은 선진국에서 장애의 주된 이유를 나타냅니다. 세포 이식에 의한 퇴화 광수용체의 교체는 향후 임상 적용에서 가능한 치료 옵션을 나타낸다. 실제로, 최근 전임상 연구는 산후 4일째에 신생아 마우스 망막에서 분리된 미성숙광수용체가 침전 이식 후 성인 마우스 망막에 통합될 가능성이 있음을 입증했습니다. 기증자 세포는 내과성 양극성 세포에 근접하여 내부 및 외부 세그먼트, 외부 핵 층에 위치한 둥근 세포 체, 시냅스 말기를 포함한 성숙한 광수용체 형태를 생성하였다. 실제로, 최근 보고서는 기증자 광수용체가 기능적으로 숙주 마우스의 신경 회로에 통합한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 세포 교체 접근법의 향후 임상 적용을 위해, 선택의 세포의 정제 된 현탁액을 생성하고 눈에 적절한 통합을위한 올바른 위치에 배치해야합니다. 광수용체 전구체의 농축을 위해, 선별은 기증자 세포의 유전 기자 수정을 피하기 위하여 특정 세포 표면 항원에 기초해야 합니다. 여기서 우리는 자기 관련 세포 선별(MACS) -세포 표면 마커 CD73에 기초하여 광수용체 특이기자 마우스의 신생아 망막으로부터 분리된 이식 가능한 막대 광수용체 전구체의 농축을 보여준다. 항 CD73 항체를 함유한 배양은 마이크로 비드 컨쥬게이드 이차 항체에 이어 MACS에 의한 로드 광수용체 전구체의 농축을 약 90%까지 허용하였다. 흐름 세포측정에 비해 MACS는 GMP 표준에 더 쉽게 적용할 수 있으며 많은 양의 세포를 상대적인 짧은 기간에 정렬할 수 있다는 장점이 있습니다. 성인 야생형 마우스의 하수 공간에 농축된 세포 현탁액을 주입하면 분류되지 않은 세포 현탁액에 비해 3배 더 높은 통합률을 보였습니다.
Introduction
시력은 인간의 주요 감각 중 하나입니다. 이러한 감각과 실명의 장애는 선진국의 장애의 주된 이유 중 하나입니다. 시력 장애 또는 실명에 대한 주된 원인은 황반 변성, 망막 색소, 콘로드 이영양증 및 기타 조건에서 관찰될 수 있으므로 광수용체 세포 손실을 특징으로 하는 망막 변성입니다. 현재까지 잃어버린 시력을 복원하는 효과적인 치료법은 제공되지 않습니다. 2006년과 2008년에 는 서로 독립적으로, 영성 야생형 마우스망막1,2로막대 광수용체 전구체 세포를 성공적으로 이식하는 두 개의 상이한 실험실을 보고하였다. 따라서, 광수용체 전구체 세포 이식의 가능성을 발생시키고 또한 퇴화 된 망막으로, 퇴화 광수용체를 대체하고 시력을 회복시킨다. 실제로, 최근에는 이식된 광수용체 전구체세포가 제대로 발달된 외부 세그먼트3,시냅스 말단과 외부 핵층2-4에위치한 둥근 세포 체와 근접한 성숙한 야생형 광수용체의 형태학적 기준을 유도하고 있으며, 뿐만 아니라, 소각 회로 신경에 기능적으로 통합할 수 있는 능력도 입증되었다. 이 전략의 주요 원리 중 하나는 산후 4일 (PN 4, PN0은 출생의 날로 정의) 젊은 마우스 망막의 사용으로, 이식을위한 다른 세포 유형의 혼합물의 결과. 미래의 치료 응용 프로그램의 배경에, 이 혼합물은 광수용체 전구체 세포에 대해 정제되어야한다. CD73은 망막8-10에서젊은 광수용체에 대한 제1 세포 표면 마커로 기재되었다. 여기서, 우리는 이러한 세포 표면 마커에 기초하여 광수용체 전구체 세포 정화 방법을 시연하고 자기 관련 세포 선별(MACS) 기술을 사용한다. MACS는 빠른 정렬 시간과 GMP 조건에 대한 쉽게 조정으로 인해 형광 활성화 셀 정렬 기술에 비해 장점이 있을 수 있습니다. 우리는 성인 야생 형 망막에서 하수 공간으로 농축 된 인구를 이식 할 때 ~ 90 % 농축 및 최대 3 배 높은 통합 률을 입증 할 수 있습니다. 따라서 MACS 기반 광수용체 전구체 세포 농축 및 피망 이식은 망막 퇴성의 치료를 위한 재생 치료 전략의 개발을 위한 신뢰할 수 있고 유망한 기술이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
광수용체 전구체 세포의 침전체 이식은 이러한 빛에 민감한 세포의 통합을 달성하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 나타내며, 이는상당수1,2에서숙주 망막으로 통합된다. 이것은 미래에 망막 퇴행성 질병의 처리를 위한 세포 치료의 설치를 허용할 지도 모릅니다6. 현재 PN 4 망막으로부터 분리된 세포의 기증자 인구는 다른 세포 유형의 혼합물이며, 이 세포는 감전 주사 후 광수용체 전구체 세포만 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Nrl-GFP 마우스를 제공 아난드 스와롭, 기술 지원을위한 요헨 하스, 동물 축산에 대한 신디 뵈메와 에멜리 레스만을 제공 감사드립니다.
이 작품은 도이치 포충스게마인샤프트(DFG): FZT 111 – 재생 치료 드레스덴 센터, CRTD 종자 보조금 프로그램, SFB 655 및 프로레티나 e.V. 재단, DIGS-BB 대학원 프로그램 드레스덴, 그리고 Fundação 파라 시엔시아 e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
