MACS Saflaştırılmış Fotoreceptör Öncü Hücrelerinin Yetişkin Fare Retinasına Subretinal Transplantasyonu
Summary
Hücre nakli fotoreceptör kaybı ile karakterize retina dejenerasyonu tedavisi için bir stratejiyi temsil eder. Burada, nakledilebilir fotoreceptörlerin zenginleştirilmesi ve yetişkin farelere alt deri nakli için bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Retinanın ışık algılayan hücrelerinin, yani fotoreceptörlerin kaybına bağlı görme bozukluğu ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde temel engellilik nedenini temsil eder. Dejenere fotoreceptörlerin hücre nakli ile değiştirilmesi, gelecekteki klinik uygulamalarda olası bir tedavi seçeneğini temsil etmektedir. Nitekim, son preklinik çalışmalar, doğum sonrası 4. günde yenidoğan fare retinasından izole edilen olgunlaşmamış fotoreceptörlerin subretinal transplantasyondan sonra yetişkin fare retinasına entegre olma potansiyeline sahip olduğunu göstermiştir. Donör hücreler, iç ve dış segmentler, dış nükleer tabakada bulunan yuvarlak bir hücre gövdesi ve endojen bipolar hücrelere yakın sinaptik terminaller dahil olmak üzere olgun bir fotoreceptör morfolojisi oluşturdu. Nitekim, son raporlar donör fotoreceptörlerin konak farelerin sinir devrelerine işlevsel olarak entegre olduğunu göstermiştir. Bu tür hücre değiştirme yaklaşımının gelecekteki bir klinik uygulaması için, tercih edilen hücrelerin saflaştırılmış süspansiyonlarının üretilmesi ve göze uygun entegrasyon için doğru konuma yerleştirilmesi gerekir. Fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi için, donör hücrelerin genetik muhabir modifikasyonunun önlenmesi için sıralama belirli hücre yüzeyi antijenlerine dayanmalıdır. Burada manyetik ilişkili hücre sıralamasını (MACS) gösteriyoruz – hücre yüzeyi işaretleyici CD73’e dayanarak fotoreceptöre özgü muhabir farelerin yenidoğan retinasından izole edilen nakledilebilir çubuk fotoreceptör öncüllerinin zenginleştirilmesi. Anti-CD73 antikorları ile inkübasyon ve ardından mikro boncuk konjuge sekonder antikorlar, çubuk fotoreceptör öncüllerinin MACS tarafından zenginleştirilmesini yaklaşık% 90’a kadar sağladı. Akış sitometrisine kıyasla MACS, GMP standartlarına daha kolay uygulanabilmesi ve yüksek miktarda hücrenin nispeten kısa zaman periyotlarında sıralanabilmesi avantajına sahiptir. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonlarının yetişkin vahşi tip farelerin alt alanına enjekte etmesi, sıralanmamış hücre süspansiyonlarına kıyasla 3 kat daha yüksek entegrasyon oranına neden oldu.
Introduction
Görme, insanların en önemli duyularından biridir. Bu duygunun bozulması ve körlük, sanayileşmiş ülkelerde engelliliğin başlıca nedenlerinden biridir. Görme bozukluğu veya körlüğün baskın nedeni, makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa, koni-çubuk distrofisi ve diğer durumlarda gözlenebildiği gibi fotoreceptör hücre kaybı ile karakterize retina dejenerasyonudur. Bugüne kadar, kayıp görüşü geri yüklemek için etkili bir tedavi mevcut değildir. 2006 ve 2008’de birbirinden bağımsız iki farklı laboratuvar rapor edildi, çubuk fotoreceptör öncül hücrelerinin yetişkin vahşi tip fare retinalarına başarılı bir şekilde nakli1,2. Böylece, fotoreceptör öncüsü hücre nakli olasılığının da dejenere bir retinaya dönüşmesi, dejenere fotoreceptörlerin yerini alması ve görmeyi geri kazanma olasılığı ortaya çıkmıştır. Nitekim, son zamanlarda gösterilmiştir. bu tür nakledilen fotoreceptör öncül hücrelerin, düzgün bir şekilde geliştirilen dış segmentler3, endojen bipolar hücrelere yakın sinaptik terminaller ve dış nükleer katman2-4’tebulunan yuvarlak bir hücre gövdesi gibi olgun vahşi tip fotoreceptörlerin morfolojik kriterlerini ortaya çıkardığı ve ayrıca5-7ana sinir devresine işlevsel olarak entegre olma yeteneği . Bu stratejinin ana ilkelerinden biri, doğum sonrası 4. gün (PN 4, PN0 doğum günü olarak tanımlanır) genç fare retinalarının kullanılmasıdır ve bu da transplantasyon için farklı hücre tiplerinin bir karışımı ile sonuçlanır. Gelecekteki bir terapötik uygulamanın arka planında, bu karışımın fotoreceptör öncül hücreler için saflaştırılması gerekir. CD73 retina8-10genç fotoreceptörler için özel ilk hücre yüzey belirteci olarak tanımlanmıştır. Burada, bu hücre yüzeyi işaretleyicisine dayanan ve manyetik ilişkili hücre sıralama (MACS) tekniğinin kullanıldığı bir fotoreceptör öncül hücre temizleme yöntemini gösteriyoruz. MACS, hızlı sıralama süreleri ve GMP koşullarına daha kolay uyum sağladığı için floresanla etkinleştirilen hücre sıralama tekniklerine kıyasla avantajlara sahip olabilir. Zenginleştirilmiş popülasyonu yetişkin vahşi tip retinalarda alt alana nakledirken ~%90 zenginleştirme ve 3 kata kadar daha yüksek entegrasyon oranı gösterebiliriz. Bu nedenle, MACS tabanlı fotoreceptör öncül hücre zenginleştirme ve subretinal transplantasyon, retina dejenerasyonu tedavisi için rejeneratif terapötik stratejinin geliştirilmesi için güvenilir ve umut verici tekniklerdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fotoreceptör öncül hücrelerin subretinal nakli, bu ışığa duyarlı hücrelerin ana bilgisayar retinalarına önemli sayılarda entegrasyonunu sağlamak için güvenilir bir aracı temsil eder1,2. Bu, gelecekte retina dejeneratif hastalıkların tedavisi için bir hücre tedavisi kurulmasına izin verebilir6. Şu anda PN 4 retinalarından izole edilmiş olan hücrelerin donör popülasyonu, subretinal enjeksiyondan sonra sadece fotoreceptör öncül hücrelerin entegre olduğu farklı hücre türlerinin bir karı?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nrl-GFP fareleri sağladığı için Anand Swaroop’a, teknik destek için Jochen Haas’a ve hayvancılık için Sindy Böhme ve Emely Lessmann’a teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından desteklenmiştir: FZT 111 – Rejeneratif Terapiler Merkezi Dresden, CRTD Tohum Hibe Programı, SFB 655 ve ProRetina e.V. vakıf, DIGS-BB Lisansüstü Programı Dresden ve Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
