MACS纯化光感受器前体细胞的亚视移植到成年小鼠视网膜中
Summary
细胞移植是治疗视网膜退化的一种策略，其特征是光感受器丧失。在这里，我们描述了一种丰富可移植光感受器及其亚视移植到成年小鼠的方法。
Abstract
视网膜光感细胞（ 即 光感受器）的丧失导致视力障碍和失明，是工业化国家残疾的主要原因。通过细胞移植取代退化的光感受器是未来临床应用中一种可能的治疗选择。事实上，最近的临床前研究表明，在产后第4天从新生儿小鼠视网膜中分离出来的不成熟的光感受器，在亚视网膜移植后有可能融入成年小鼠视网膜。供体细胞产生成熟的光感受器形态，包括内段和外段、位于外核层的圆形细胞体和靠近内源性双极细胞的突触终端。事实上，最近的报告显示，供体光感受器在功能上融入宿主小鼠的神经回路。对于这种细胞替代方法的未来临床应用，必须生成选择细胞的纯化悬浮，并放置在正确的位置，以便正确地融入眼睛。对于光感受器前体的丰富，排序应基于特定的细胞表面抗原，以避免遗传报告器对供体细胞进行改造。在这里，我们显示磁相关细胞分拣 （MACS） – 丰富可移植棒光感受器前体分离出的新生儿网膜的光感受器特异性记者小鼠基于细胞表面标记CD73。与抗CD73抗体的孵化，以及微珠结合的二次抗体，使MACS的棒光感受器前体的丰富度接近90%。与流动细胞学相比，MACS 的优势在于它可以更容易地应用于 GMP 标准，并且可以在相对较短的时间内对大量细胞进行排序。将富集细胞悬浮液注入成年野生型小鼠的亚视空间，与未分类的细胞悬浮相比，整合率高3倍。
Introduction
视觉是人类的主要感觉之一。这种意识的损害和失明是工业化国家残疾的主要原因之一。视力障碍或失明的主要原因是视网膜退化，其特征是光感受器细胞丧失，因为它可以在黄斑变性、视网膜炎色素瘤、锥形杆营养不良和其他疾病中观察到。迄今为止，还没有有效的治疗方法来恢复视力丧失。2006年和2008年，两个不同的实验室分别报告，成功将杆光感受器前体细胞移植到成年野生型小鼠视网膜1，2。因此，产生光感受器前体细胞移植的可能性也到退化视网膜，以取代退化的光感受器和恢复视力。事实上，最近已经证明，这种移植的光感受器前体细胞引起成熟野生型光感受器的形态学标准，如正确开发的外段3、靠近内源性双极细胞的突触终端和位于外核层2-4的圆形细胞体，以及功能集成到主动脉电路5-7的能力。这一策略的主要原则之一是使用产后第4天（PN 4，PN0定义为出生日）幼鼠视网膜，从而产生不同细胞类型的混合移植。在未来治疗应用的背景下，这种混合物必须纯化为光感受器前体细胞。CD73被描述为第一个细胞表面标记，专门为年轻的光感受器在网膜8-10。在这里，我们演示了基于此细胞表面标记的光感知器前体细胞净化方法，并采用了磁相关细胞分拣 （MACS） 技术。与荧光激活的细胞分拣技术相比，MACS 可能有优势，因为分拣时间快，对 GMP 条件的调整也更容易。当将富集的人口移植到成人野生型视网膜的亚视网膜空间时，我们可以证明其富足度为 90%，融合率高达 3 倍。因此，基于MACS的光感受器前体细胞富集和亚视网膜移植，是开发视网膜退化治疗再生治疗策略的可靠和有前途的技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
光感受器前体细胞的亚视移植是实现这些光敏细胞在大量1，2中融入宿主视网膜的可靠工具。这可能使建立一个细胞疗法，用于治疗视网膜退行性疾病在未来6。细胞的供体群，目前从PN 4视网膜分离，是不同细胞类型的混合物，只有光感受器前体细胞在亚视网膜注射后整合。通过使用基于CD73的MAC排序，供体细胞悬架中的光感受器比例可以增加到≈90%，与未分类的细胞群8相比，野生型宿主?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢阿南德·斯瓦鲁普为Nrl-GFP小鼠、乔琴·哈斯提供技术支持，以及辛迪·布姆和埃米利·莱斯曼提供畜牧业。
这项工作得到了德国福松斯格梅因沙夫特（DFG）：FZT 111 – 德累斯顿再生疗法中心、CRTD种子赠款计划、SFB 655和普罗雷蒂娜e.V.的支持。 基金会、DIGS-BB德累斯顿研究生课程和特克诺洛尼亚基金会（SFRH/BD/60787/2009）
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
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