在这里,我们描述了一个程序,用传输电子显微镜以纳米分辨率对液体中的病毒复合物进行成像。
研究人员定期使用透电电子显微镜(TEM)来检查生物实体和评估新材料。在这里,我们描述了这些仪器的附加应用 – 在液体环境中查看病毒组件。这种令人激动和新颖的生物结构可视化方法利用了最近开发的基于微流体的标本支架。我们的视频文章演示了如何组装和使用微流体支架在 TEM 内对液体标本进行成像。特别是,我们使用模拟轮状病毒双层颗粒 (DLP) 作为我们的模型系统。我们还描述了用亲和力生物膜覆盖液体室表面的步骤,这些生物膜将 DLP 与观看窗口绑在一起。这使我们能够以适合 3D 结构确定的方式对组件进行成像。因此,我们首次在原生液体环境中看到亚病毒粒子。
生物学家和工程师的共同目标是了解分子机器的内部工作。传输电子显微镜 (TEM) 是以近原子分辨率1-2可视化这些复杂细节的理想仪器。为了维持TEM的高真空系统,生物样本通常嵌入在薄膜的微薄冰3,糖4,重金属盐5,或其中的一些组合6。因此,嵌入式标本的图像可能只显示动态过程的有限快照。
帕森斯及其同事利用差分泵送阶段,对环境液体室中水合的生物标本进行了早期维护尝试。未染色催化晶体的电子衍射模式在水合状态7-8中被成功记录到3的分辨率。此外,相分离的脂质域可以在人类红细胞9-10的水合膜中检查。然而,由于扩散液体及其对电子束的干扰引起的运动导致严重分辨率损失,直到最近才尝试使用生物标本进行进一步实验。
新开发的微流体标本持有者已引进,利用半导体微芯片形成微尺度环境室。这些设备可以在将样品放置在 TEM 列11-12中时,将样品保持在液体中。TEM成像技术上的这一突破使研究人员首次能够在分子水平13上看到渐进事件。我们称这种新模式为”原位 分子显微镜”,因为现在可以在EM列14-15的”内部”进行实验。该方法的总体目标是在液体中对生物组件进行成像,以便以纳米分辨率观察其动态行为。开发技术背后的理由是记录实时观测,并检查生物机械在溶液中的新特性。这种方法扩展了TEM在细胞和分子生物学12-16中用于更广泛的目的。
在当前的视频文章中,我们提出了一个全面的协议,以组装和使用市售的微流体标本支架。这些专业支架利用用集成垫片生产的氮化硅微芯片形成一个液体腔室,将微量溶液包围起来。薄而透明的窗户被蚀刻在微芯片中,用于成像目的12。我们演示了使用微流体支架使用 TEM 检查液体中的模拟轮状病毒双层颗粒 (DLP) 的正确用途。为了确保生物组件(如DLP)在成像时不会在很远的距离上快速扩散,我们采用亲和力捕获方法将它们系在微流体16的表面。与液体中生物标本成像 的替代技术而言 ,这种分子捕获步骤具有重大优势,因为它允许获取用于下游处理程序的图像。这个捕获步骤与微流体成像相结合,是我们程序17所独有的。使用 TEM 或微流体成像室使用结构生物学应用程序的读者可能会考虑在分子水平上的动态观测是最终目标时使用亲和力捕获技术。
在我们的介绍工作中,我们采用亲和力捕获方法将轮状病毒 DLP 系在微流体平台上。这允许在液体微环境下对大分子复合物进行 原位 成像。捕获 方法对于其他微流体成像技术具有重要意义 ,因为它将生物标本定位到成像窗口,以否定在以液体中记录图像时出现的大型扩散问题。然而, 我们协议中最关键的步骤 之一是将脂质生物膜转移到微芯片表面。如果脂质单层…
The authors have nothing to disclose.
作者感谢弗吉尼亚理工大学卡里里昂研究所所长迈克尔·弗里德兰德博士鼓励我们的研究努力。该项目得到了S.M.M和D.F.K.的发展基金的支持,部分得到了弗吉尼亚理工大学关键技术和应用科学研究所的纳米生物倡议的支持。
E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
Equipment | |||
Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |