Lymphknoten sind die immunologischen Gewebe, die die Immunantwort orchestrieren und ein kritisches Ziel für Impfstoffe sind. Biomaterialien wurden eingesetzt, um Lymphknoten besser anzusprechen und die Abgabe von Antigenen oder Hilfsstoffen zu kontrollieren. Dieser Artikel beschreibt eine Technik, die diese Ideen kombiniert, um biokompatible Polymerpartikel in Lymphknoten zu injizieren.
Die Generierung der adaptiven Immunantwort beruht auf einer effizienten Drainage oder dem Handel mit Antigen-Lymphknoten zur Verarbeitung und Darstellung dieser fremden Moleküle in T- und B-Lymphozyten. Lymphknoten sind somit zu kritischen Zielen für neue Impfstoffe und Immuntherapien geworden. Eine neue Strategie zur Gezielten Ausrichtung auf diese Gewebe ist die direkte Lymphknoteninjektion von löslichen Impfstoffkomponenten, und klinische Studien mit dieser Technik waren vielversprechend. Mehrere Biomaterialstrategien wurden ebenfalls untersucht, um das Lymphknotenziel zu verbessern, z. B. die Partikelgröße für eine optimale Drainage von biomaterial-Impfstoffpartikeln. In diesem Beitrag stellen wir eine neue Methode vor, die die direkte Lymphknoteninjektion mit biologisch abbaubaren Polymerpartikeln kombiniert, die mit Antigen-, Adjuvans- oder anderen Impfstoffkomponenten beladen werden können. Bei diesem Verfahren werden polymere Mikropartikel oder Nanopartikel durch ein modifiziertes Doppelemulsionsprotokoll mit Lipidstabilisatoren synthetisiert. Partikeleigenschaften(z.B. Größe, Ladungsbelastung) werden durch Laserbeugung bzw. Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Maus-Lymphknoten werden dann durch periphere Injektion eines ungiftigen Tracerfarbstoffs identifiziert, der die Visualisierung der Zielinjektionsstelle und die anschließende Ablagerung von Polymerpartikeln in Lymphknoten ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine direkte Kontrolle der Dosen und Kombinationen von Biomaterialien und Impfstoffkomponenten, die an Lymphknoten geliefert werden, und könnte bei der Entwicklung neuer biomaterialbasierter Impfstoffe genutzt werden.
Die Lymphknoten (LNs) sind die Kommandozentralen des Immunsystems. An dieser immunologischen Stelle, Antigen präsentieren den Zellen Primieren naiver Lymphozyten gegen bestimmte fremde Antigene, um zelluläre und humorale Immunantworten zu aktivieren. LNs sind damit zu einem attraktiven Ziel für die Lieferung von Impfstoffen und Immuntherapien geworden. Leider führen die meisten Impfstoffstrategien zu einer ineffizienten, vorübergehenden Abgabe von Antigenen und Hilfsstoffen an das Lymphgewebe1. Ansätze, die die Ausrichtung und Retention von Impfstoffkomponenten in LNs verbessern, könnten daher erhebliche Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Effizienz neuer Impfstoffe haben.
Eine Strategie zur Umgehung der Herausforderung des LN-Targetings, die großes Interesse an neuen klinischen Studien gezeigt hat, ist die direkte, intra-LN (i.LN.) Injektion2-4. Diese Studien verwendeten Ultraschall-Leitlinien, um Impfstoffe an LNs als einfaches ambulantes Verfahren zu liefern. Im Vergleich zu herkömmlichen peripheren Injektionsrouten führte dieser Ansatz zu einer signifikanten dosissparenden und verbesserten Wirksamkeit in therapeutischen Kontexten, einschließlich Allergien und Krebs2-4. In diesen Studien wurden i.LN.-Injektionen von löslichen Impfstoffen(d.h. biomaterialfrei) eingesetzt, die durch Lymphdrainage schnell gerodet wurden. Daher wurden mehrere Injektionen – oder Zyklen von Mehrfachinjektionen – verabreicht, um diese beeindruckenden therapeutischen Effekte zu erzielen. Verbesserte Retention in der LN könnte die Interaktion zwischen Antigen und /oder adjuvanten und Immunzellen verbessern, weiter verbesserung der Wirksamkeit der Immunzellgrundierung. Dieses Potenzial wird durch aktuelle Studien unterstützt, die zeigen, dass die Kinetik der Antigen- und Adjuvans-Entbindung eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der spezifischen Immunantwort spielt, die5-7erzeugt wird. Darüber hinaus könnte die Lokalisierung und Minimierung von Medikamenten- und Impfstoffdosen systemische Effekte wie chronische Entzündungen reduzieren oder eliminieren.
Biomaterialien wurden ausgiebig untersucht, um die Wirksamkeit und Effizienz von Impfstoffen zu verbessern1,8,9. Die Verkapselung oder Adsorption auf Biomaterialträgern kann Fracht physisch vor Demintizugung schützen und Löslichkeitsbeschränkungen überwinden. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal von Biomaterialträgern, wie z. B. polymeren Mikro- oder Nanopartikeln, ist die Fähigkeit, mehrere Ladungsklassen zu beladen und anschließend diese Ladungen in kontrollierten Intervallen freizugeben. Eine signifikante Einschränkung, die Biomaterial-Impfstoffe und Immuntherapien in vivo weiterhin behindert, ist jedoch eine ineffiziente Ausrichtung auf Immunzellen und der eingeschränkte Handel mit Lymphknoten. Beispielsweise weist die periphere Injektion von Biomaterialimpfstoffen über konventionelle Wege(z. B. intradermale, intramuskuläre) in der Regel eine schlechte LN-Ausrichtung auf, wobei bis zu 99 % des injizierten Materials an der Injektionsstelleverbleiben 4,10. In jüngerer Zeit wurde die Größe der Träger von Biomaterial-Impfstoffen darauf abgestimmt, den präferenziellen Handel oder die Entwässerung dieser Impfstoffe an LNs durch interstitielle Strömungenden 8,10zu verbessern. Diese Fortschritte haben zu verbesserten zellulären und humoralen Immunreaktionen geführt und die Bedeutung der Ausrichtung und Entwicklung der LN-Umgebung für neue Impfstoffe unterstrichen.
Dieses Papier stellt ein Impfprotokoll vor, das lipidstabilisierte Polymerpartikel und i.LN. Lieferung kombiniert, um kontrollierte Freisetzungsimpfstoffdepots zu erzeugen5,11. Aufbauend auf neueren Studien mit chirurgischen Techniken für i.LN. bei Mäusen6,7,12,13haben wir eine schnelle, nicht-chirurgische Strategie zur Injektion von Biomaterial-Impfstoffen bei Kleintieren entwickelt5. Kombination der i.LN-Lieferung mit Biomaterial-Impfstoffträgern verbesserte die CD8-T-Zellreaktion innerhalb von 7 Tagen nach einer einmaligen Injektion von kontrollierten Freisetzungsimpfstoffdepots5. Es wurde auch eine starke humoristische Reaktion(d.h. Antikörpertiter) erzeugt; Beide Verbesserungen waren mit einer erhöhten Retention von Impfstoffkomponenten in Lymphknoten verbunden, die durch kontrollierte Freisetzung aus den Biomaterialträgern vermittelt wurde. Interessanterweise veränderte die Größe der Impfstoffpartikel das Schicksal dieser Materialien einmal in den LNs: Nanopartikel zeigten eine erhöhte direkte Aufnahme durch Zellen, während größere Mikropartikel in der extrazellulären LN-Umgebung blieben und freigesetzte Ladung(z. B. Adjuvans) freigesetzt wurde, die von LN-residenten Antigen-Darstellungszellen5aufgenommen wurde. Diese Daten deuten auf zwei Wege hin, die durch die Kontrolle der Größe der i.LN injizierten Biomaterialien für neue Impfstoffe genutzt werden könnten.
In diesem Artikel werden biologisch abbaubare lipidstabilisierte Polymerpartikel (mikro- und nanoskal) mit einer modifizierten Doppelemulsionsstrategie synthetisiert5,11. Die Partikeleigenschaften zeichnen sich durch Laserbeugung und Mikroskopie aus. Diese Partikel werden dann direkt in die Leisten-LNs injiziert, die nichtchirurgisch mit einem gemeinsamen, ungiftigen Tracerfarbstoff14identifiziert wurden. Die Nachinjektionsanalyse von LNs durch Histologie oder Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Verteilung von Partikeln innerhalb der LN-Umgebung zu überprüfen sowie die zelluläre Aufnahme und Retention von Partikeln im Laufe der Zeit zu überwachen. Für Protokolle, die die histologische Verarbeitung und die Durchflusszytometrie beschreiben, werden die Leser auf aktuelle JoVE-Artikel und Journalberichte15-22verwiesen. Typische Ergebnisse zeigen lokale LN-Targeting dieser Depots, die genutzt werden könnten, um potente, effiziente Immunantworten zu erreichen oder die Immunität für Zielerreger anzupassen.
Die in diesem Protokoll beschriebene Technik ermöglicht die kontrollierte Abgabe von Impfstoffen an LNs und an LN-residente Antigen-präsentierende Zellen. Biomaterial verkapselte Ladung kann innerhalb der LN lokalisiert werden, so dass die Dosen einer oder mehrerer Arten von Fracht, die an die LN-Mikroumgebung geliefert werden, manipuliert werden können. Die Lokalisierung und kontrollierte Freisetzung von Polymerpartikeln hat gezeigt, dass eine starke zelluläre und humorale Immunantwort bei deutlich niedrigeren Dosen als herkömmliche Ansätze erzeugt wird. Darüber hinaus kann durch die Manipulation der Biomaterialträgergröße die primäre Art der zellulären Verarbeitung zwischen der direkten Aufnahme von Nanopartikeln oder der extrazellulären Ladungsfreisetzung aus größeren Mikropartikelnmoduliertwerden 5 . Diese Ergebnisse belegen die Machbarkeit der i.LN. Biomaterial-Lieferung als Plattform für die therapeutische Impfstoffabgabe.
Die Synthese von PLGA-Partikeln durch Emulsion/Lösungsmittelverdampfung wurde in Anwendungen zur Arzneimittelabgabe weit verbreitet23,24. Potenzielle Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik betreffen daher vor allem die erfolgreiche Identifizierung und Ablagerung von Impfstoffen am LN-Zielstandort. Obwohl die Verwendung von Tracerfarbstoff die Visualisierung der gezielten Leisten-LNs erleichtert, sind die Zielgröße und -tiefe unter der Haut klein. Daher empfehlen die Autoren, Zeit und Mäuse für die Zubereitung und Injektion von Mäusen zu zuteilen. Während der Tiervorbereitung(d.h. Rasur und Anwendung der Enthaarung) sollte darauf geachtet werden, die Mäuse nicht auf der ventralen Seite des Tieres zu schneiden, wo der Winkel des Beins mit dem Bauch die Haut anfälliger für Verletzungen durch Clippers macht. Darüber hinaus sollte alle Enthaarungsmittel mit warmem Wasser entfernt werden, um zu verhindern, dass Tiere die Creme während des normalen Pflegeverhaltens vernehmen. Um LN-Injektionen zu praktizieren, kann eine höhere Tracer-Farbstoff-Konzentration verabreicht und Praxistiere eingeschläfert und dann mehrmals injiziert werden. Nach der Injektion können Mäuse nekroropiniert werden und die Größe von LNs von injizierten Tieren kann mit einer nicht injizierten Kontrolle LN verglichen werden. Eine Einschränkung dieser Technik ist die physikalische Grenze des Injektionsvolumens, die in die LN-Struktur geladen werden kann. Unser Protokoll schlägt ein Injektionsvolumen von 10 l bei Mäusen vor, obwohl andere Studien größere Injektionsvolumina von mindestens 20 l berichtet haben.13 Die direkte Lieferung von Impfstoffen über i.LN. Die Injektion ermöglicht jedoch eine dramatische Dosisersparnis, so dass die Funktion dieser Impfstoffe in der Regel nicht durch Volumenbeschränkungen eingeschränkt werden sollte.
Wie bereits erwähnt, ist die Änderung der physikalischen Eigenschaft der Partikel(d. h. Größe) ein effektiver Mechanismus, um den Durchweg oder die Ergebnisse zu verändern, die durch Biomaterialien und verkapselte Ladungen im LN-Gewebe induziert werden. Das Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungsprotokoll kann leicht geändert werden, um physikalische oder chemische Eigenschaften wie Oberflächenladung oder Funktionalität und die Rate der biologischen Abbau-/Ladungsfreisetzung23,24zu verändern. Beispielsweise kann die Freisetzungskinetik durch alternative Polymerzusammensetzungen abgestimmt werden, und die Oberflächenfunktion kann mit modifizierten Lipidzusammensetzungen oder Poly(Vinylalkohol) verändert werden. Die in Partikel verladene Ladung kann leicht manipuliert werden, um verschiedene Antigene oder Hilfsstoffe für Zielerreger zu enthalten. Der Vorteil dieses Ansatzes wird durch die Kombination von i.LN. Lieferung mit lokaler, kontrollierter Freisetzung von Ladung aus Biomaterialien erreicht. Diese Synergie schafft eine Plattform, die genutzt werden kann, um effiziente adaptive Immunantworten mit winzigen Dosen und mit reduzierten unspezifischen/systemischen Nebenwirkungen zu generieren.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde zum Teil von der PhRMA-Stiftung und einem Research and Scholar Award der University of Maryland, College Park, finanziert. Wir danken Prof. Darrell Irvine für die Unterstützung der ersten Arbeiten, die bei der Fertigstellung der“In-situ-Engineering des Lymphknoten-Mikroumgebung sperekten Durchdriniierung von adjuvant-releasing Polymerpartikeln” durchgeführt wurden. 5
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |