Лимфатические узлы являются иммунологическими тканями, которые оркеструют иммунный ответ и являются критической мишенью для вакцин. Биоматериалы были использованы для улучшения целевых лимфатических узлов и контроля доставки антигенов или адъювантов. В этой статье описывается метод объединения этих идей для введения биосовместимых частиц полимера в лимфатические узлы.
Поколение адаптивного иммунного ответа опирается на эффективный дренаж или оборот антигена в лимфатические узлы для обработки и представления этих иных молекул Т и В лимфоцитам. Таким образом, лимфатические узлы стали важнейшими целями для новых вакцин и иммунотерапии. Недавняя стратегия ориентации этих тканей является прямой лимфы узлов инъекции растворимых компонентов вакцины, и клинические испытания с участием этого метода были многообещающими. Было также исследовано несколько стратегий биоматериала для улучшения ориентации лимфатических узлов, например, настройки размера частиц для оптимального дренажа частиц биоматериалной вакцины. В этой статье мы представляем новый метод, который сочетает в себе прямую инъекцию лимфатических узлов с биоразлагаемыми частицами полимера, которые могут быть нагружены антигеном, адъювантом или другими компонентами вакцины. В этом методе полимерные микрочастицы или наночастицы синтезируются модифицированным протоколом двойной эмульсии, включающим липидные стабилизаторы. Свойства частиц(например, размер, погрузка груза) подтверждаются лазерной дифракцией и флуоресцентной микроскопией, соответственно. Затем лимфатические узлы мыши идентифицируются путем периферической инъекции нетоксического красителя трассировщика, который позволяет визуализировать место инъекций цели и последующее осаждение частиц полимера в лимфатических узлах. Этот метод позволяет осуществлять прямой контроль над дозами и комбинациями биоматериалов и компонентов вакцины, поставляемых в лимфатические узлы, и может быть использован для разработки новых вакцин на основе биоматериала.
Лимфатические узлы (LNs) являются командных центров иммунной системы. На этом иммунологическом участке антиген, представляя клетки, премьер наивные лимфоциты против конкретных иностранных антигенов для активации клеточных и гуморальных иммунных реакций. Таким образом, ЛП стали привлекательной мишенью для доставки вакцин и иммунотерапии. К сожалению, большинство стратегий вакцины приводят к неэффективной, преходящей доставке антигена и адъювантов в лимфоиднуюткань 1. Таким образом, подходы, направленные на улучшение ориентации и удержания компонентов вакцины в ЛП, могут оказать значительное воздействие на эффективность и дей силу новых вакцин.
Одной из стратегий для обхода проблемы LN ориентации, которая продемонстрировала большой интерес к новым клиническим испытаниям является прямой,внутри-LN (i.LN.)инъекции 2-4. В этих испытаниях использовались ультразвуковые рекомендации для доставки вакцин в LNs в качестве простой амбулаторной процедуры. По сравнению с традиционными периферийных маршрутов инъекций, этот подход привел к значительной дозы щадящей и повышение эффективности в терапевтических контекстах,включая аллергию и рак 2-4. В этих исследованиях использовалась инъекция растворимых вакцин (т.е. без биоматериала), которые были быстро очищены лимфатическим дренажем. Таким образом, несколько инъекций или циклов нескольких инъекций были введены для достижения этих впечатляющих терапевтических эффектов. Улучшение удержания в ЛН может повысить взаимодействие между антигеном и / или адъювантных и иммунных клеток, дальнейшее улучшение потенции иммунных клеток грунтовки. Этот потенциал подтверждается недавними исследованиями, которые показывают, кинетика антигена и адъювантных доставки играют решающую роль в определении конкретного иммунногоответа генерируется 5-7. Кроме того, локализация и минимизация доз лекарств и вакцин может уменьшить или устранить системные последствия, такие как хроническое воспаление.
Биоматериалы были изучены широко для повышения потенции и эффективности вакцин1,8,9. Инкапсуляция или асорпция на носителях биоматериала может физически оградить груз от деградации и преодолеть ограничения на слугот. Еще одной примечательной особенностью носителей биоматериала, таких как полимерные микро- или наночастицы, является возможность совместной загрузки нескольких классов грузов и, впоследствии, высвобождения этих грузов через контролируемые промежутки времени. Однако значительным ограничением, которое по-прежнему препятствует биоматериальным вакцинам и иммунотерапии in vivo, является неэффективная ориентация на иммунные клетки и ограниченный оборот лимфатических узлов. Например, периферические инъекции биоматериальных вакцин по обычным маршрутам(например, внутридермальные, внутримышечные), как правило, демонстрируют плохое таргетирование ЛН, при этом до 99% инъекционного материала остается в местеинъекции 4,10. Совсем недавно, размер носителей биоматериалной вакцины был настроен для улучшения преференциального оборота или дренажа этих вакцин в LNs черезинтерстициальный поток 8,10. Эти достижения привели к усилению клеточной и гуморальной иммунной реакции, подчеркивая важность ориентации и разработки среды ЛН для новых вакцин.
В настоящем документе представлен протокол вакцинации, который сочетает в себе липидно-стабилизированные частицы полимера и i.LN. доставки для создания контролируемыхскладов вакцины релиз 5,11. Опираясь на последние исследования с использованием хирургических методов для i.LN. умышей 6,7,12,13, мы разработали быструю, нехирургическую стратегию для инъекций биоматериалов вакцин у мелкихживотных 5. Сочетание i.LN. доставки с носителями биоматериалной вакцины мощно расширенный CD8 Т-клеток ответ в течение 7 дней после одной инъекции контролируемых депо вакцинырелиз 5. Также был получен сильныйюмористический ответ (т.е. титеры антител); оба усовершенствования были связаны с увеличением удержания компонентов вакцины в лимфатических узлах, которые были опосредовано контролируемым высвобождением из носителей биоматериала. Интересно, что размер частиц вакцины изменил судьбу этих материалов один раз в LNs: наномасштабные частицы показали повышенное прямое поглощение клетками, в то время как более крупные микрочастицы оставались во внеклеточной среде LN и выпустили груз (например, адъювант), который был взят на себя LN-резидентов антигенапредставления клеток 5. Эти данные свидетельствуют о двух путях, которые могут быть использованы для новых вакцин, контролируя размер биоматериалов, введенных i.LN.
В этой статье биоразлагаемые липидно-стабилизированные полимерные частицы (микро- и наномасштабные) синтезируются с использованием модифицированной стратегиидвойной эмульсии 5,11. Свойства частиц характеризуются лазерной дифракцией и микроскопией. Эти частицы затем вводятся непосредственно в паховой LNs определены нехирургически с помощью общего, нетоксического красителятрассировщика 14. Постинкурсный анализ LNs с помощью гистологии или цитометрии потока может быть использован для проверки распределения частиц в среде LN, а также для мониторинга клеточного поглощения и удержания частиц с течением времени. Для протоколов с подробным описанием гистологической обработки и цитометрии потока читатели ссылаются на последние статьи JoVE ижурнальные отчеты 15-22. Типичные результаты демонстрируют локальные LN ориентации этих складов, которые могут быть использованы для достижения мощных, эффективных иммунных реакций или адаптировать иммунитет для целевых патогенов.
Техника, описанная в этом протоколе, позволяет контролировать доставку вакцин в LNs и в LN-резидент антиген, представляя клетки. Инкапсулированный биоматериал может быть локализован в пределах ЛН, что позволяет манипулировать дозами одного или нескольких видов груза, доставленного в микрооквидение ЛН. Было показано, что локализация и контролируемое высвобождение из полимерных частиц генерируют мощный клеточный и гуморальный иммунный ответ в значительно более низких дозах, чем обычные подходы. Кроме того, путем манипуляции размером носителя биоматериала, основной способ клеточной обработки может быть модулирован между прямым поглощением наночастиц или внеклеточным высвобождением груза из большихмикрочастиц 5. Эти результаты устанавливают целесообразность доставки биоматериала i.LN. в качестве платформы для доставки терапевтической вакцины.
Синтез частиц PLGA путем эмульсии/растворительной испарения широко используется в приложениях для доставкилекарств 23,24. Таким образом, потенциальные проблемы, связанные с этим методом, связаны главным образом с успешной идентификацией и осаждением вакцин на целевом объекте ЛН. Хотя использование красителя трассировщик облегчает визуализацию целевых паховых LNs, целевой размер и глубина под кожей малы. Так, авторы рекомендуют ото выделение времени и мышам на практику приготовления и инъекций мышей. Во время приготовленияживотного (т.е. бритья и применения депиля, следует позаботиться о том, чтобы мышей не разрезали на брюшной стороне животного, где угол ноги с животом делает кожу более подверженной травмам от клиперов. Кроме того, все депиляния должны быть удалены с теплой водой, чтобы предотвратить животных от инга крема во время нормального поведения ухода. Для практики инъекций ЛН, более высокая концентрация красителя трассировщика может быть введена и практика животных могут быть усыпаны, а затем вводят несколько раз. После инъекции мышей можно некропсить и размер LNs от инъекционных животных можно сравнить с необъективным контролем LN. Одним из ограничений этого метода является физический предел объема впрыска, который может быть загружен в структуру LN. Наш протокол предполагает объем инъекций 10 л у мышей, хотя другие исследования сообщили большие объемы инъекций по крайней мере выше, чем 20 мл.13 Тем не менее, прямая доставка вакцин через i.LN. инъекции позволяет драматические дозы щадящие поэтому функция этих вакцин, как правило, не должны быть ограничены ограничениями объема.
Как отмечалось, изменение физического свойства частиц(т.е. размера) является эффективным механизмом изменения пути или результатов, вызванных биоматериалами и инкапсулированными грузами в тканях ЛН. Протокол испарения эмульсии/растворителя может быть легко изменен для изменения физических или химических свойств, таких как поверхностный заряд или функциональность, а скорость биодеградации/высвобождениягруза 23,24. Например, кинетики выпуска могут быть настроены с помощью альтернативных полимерных композиций, и функции поверхности могут быть изменены с помощью модифицированных липидных композиций или поли (виниловый спирт). Груз, загруженный частицами, можно легко манипулировать, чтобы содержать различные антигены или адъюванты для целевых патогенов. Преимущество этого подхода достигается за счет сочетания доставки i.LN. с местным контролируемым высвобождением груза из биоматериалов. Эта синергия устанавливает платформу, которая может быть использована для эффективного создания адаптивной иммунной реакции с использованием мельчайших доз и с уменьшенными неспецифическими/системными побочными эффектами.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично профинансирована фондом PhRMA и премией в области исследований и ученых от Университета Мэриленда, Колледж-Парк. Мы благодарим профессора Даррелла Ирвина за поддержку первоначальной работы, проведенной в завершении«институции микроокнолинизации лимфатических узлов с помощью внутринодальной инъекции адъювантно-выпускающих полимерных частиц». 5 Лет
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG) | Avanti Polar Lipids | 880128 | 10 mg/ml stock in chloroform |
1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride salt (DOTAP) | Avanti Polar Lipids | 890890 | 10 mg/ml stock in chloroform |
Polylactic-co-glycolic acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | P2191 | Lactide:Glycolide (50:50). MW 30,000-60,000 |
Dichloromethane (DCM) | VWR | BDH1113 | |
Isoflurane | Vetone | 502017 | |
Nair | Nair | ||
Evans blue tracer dye | VWR | AAA16774-09 | |
U-100 BD Ultra-Fine Short Insulin Syringes, 31 G 5/16 in needle | VWR | BD328418 | |
Single-Use Needles, BD Medical, 21 G, 1.5 in needle | VWR | BD305167 | |
Syringes with BD Luer-Lok Tip, BD Medical, 1 ml | VWR | BD309628 | |
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning, 40 µm | VWR | 21008-949 | |
Vybrant DiD Cell-Labeling Solution | Invitrogen | V-22887 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 6.00 µm | Polysciences | 17149 | |
Fluoresbrite YG Microspheres 0.05 µm | Polysciences | 17156 | |
Ovalbumin, Purified | Worthington Biochemical | LS003056 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Qsonica Sonicator Ultrasonic Processor Q125 | Qsonica | Q125 | 1/8 in diameter microtip probe |
Ultra-Turrax T 25 digital homogenizer | IKA | YO-04739-22 | 10 G dispersing element |
Fluorescent Microscope | Olympus | IX-83 | |
Laser Diffraction Particle Size Distribution Analyzer | Horiba | LA-950 | Including provided cuvette-style glass fraction cell |
Professional 8685 Peanut Classic Clippers | Wahl |