Una procedura per l'impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali
Summary
Impiantare array organizzate di microfili per l'uso in single-unit registrazioni elettrofisiologiche presenta una serie di sfide tecniche. Sono descritti metodi per eseguire questa tecnica e le attrezzature necessarie. Inoltre, i frutti di un array Microconduttori organizzati per registrare da sub-regioni neurali distinti con elevata selettività spaziale è discusso.
Abstract
In vivo registrazioni elettrofisiologiche nella veglia, animali comportarsi forniscono un potente metodo per la comprensione segnalazione neurale a livello di singola cellula. La tecnica consente sperimentatori di esaminare temporalmente e regionale modelli di cottura specifici al fine di correlare i potenziali d'azione registrati con il comportamento in corso. Inoltre, le registrazioni singola unità possono essere combinati con una pletora di altre tecniche per produrre spiegazioni complete della funzione neurale. In questo articolo, descriviamo l'anestesia e la preparazione per Microwire impianto. Successivamente, annoveriamo l'attrezzatura necessaria e passaggi chirurgici per inserire con precisione una matrice microconduttori in una struttura di destinazione. Infine, descriviamo brevemente l'attrezzatura utilizzata per registrare da ciascun elettrodo nella matrice. Gli array Microconduttori fissi descritti sono particolarmente adatti per l'impianto cronica e consentono registrazioni longitudinali di dati neurali in quasi tutte le Preparati comportamentalion. Discutiamo rintracciamento brani elettrodi per triangolare posizioni Microconduttori nonché modi per combinare microconduttori impianto con tecniche di immunoistochimica per aumentare la specificità anatomica dei risultati registrati.
Introduction
Registrazioni elettrofisiologiche permettono agli scienziati di esaminare le proprietà elettriche delle cellule biologiche. Nel sistema nervoso centrale, in cui gli impulsi elettrici servono come meccanismo di segnalazione, queste registrazioni sono di particolare importanza per la comprensione funzione neurale 1-2. Durante le registrazioni singola unità a comportarsi animali, un microelettrodo che è stato inserito nel cervello è in grado di registrare i cambiamenti nella generazione di un neurone di potenziali d'azione nel corso del tempo.
Mentre molte tecniche permettono di registrare l'attività cerebrale, monoblocco elettrofisiologia è uno dei metodi più precisi consentendo risoluzione a livello di singolo neurone. Quando si desidera un alto grado di specificità spaziale, microfili possono essere utilizzati per indirizzare discreti sotto-nuclei o insiemi di cellule all'interno del brain3. Registrazioni singola unità beneficiano anche di alta risoluzione temporale registrazioni sono accurate a livello di microsecondo. E, in vivo unregistrazioni veglia consentono interazioni circuito intatto, con l'ambiente naturale della afferenti ed efferenti proiezioni, chimico sistemico e influenze ormonali e parametri fisiologici. Segnali neurali sono derivati da input sensoriali, comportamenti motori, elaborazione cognitiva, neurochimica / farmacologia, o una combinazione. Di conseguenza, la segregazione di sensoriali, motorie, cognitive, e chimiche influenze richiede esperimenti ben concepiti, con rischi e controlli efficaci che possono consentire per la valutazione di ciascuna delle influenze di cui sopra. Tutto sommato, le registrazioni a comportarsi animali permettono sperimentatori di osservare l'integrazione di più fonti di informazioni all'interno di un circuito funzionante e per derivare un modello più completo della funzione del circuito.
Registrazioni singola unità soffrono anche di una serie di svantaggi, la cui sperimentatore deve essere consapevole. In primo luogo, le registrazioni possono essere difficili da condurre. Infatti, le proprietà di the amplificatori Headstage e le microfili impiantati che permettono specificità spaziale e temporale in queste registrazioni rende anche registrazioni suscettibile all'influenza di segnali elettrici estranei (cioè "disturbo" elettrico). Di conseguenza, la capacità di risolvere i problemi in un sistema elettrofisiologico richiede una comprensione tecnica ben sviluppata di principi e apparecchi elettrofisiologici. E 'anche importante notare che, in determinate circostanze, segnali elettrici registrati nelle registrazioni extracellulari possono rappresentare la somma di più segnali neurali. Inoltre, la generalizzazione dell'attività singola unità all'attività popolazione all'interno di una regione bersaglio può spesso essere limitata dal grado di eterogeneità cellulare all'interno della regione bersaglio (ma vedi Cardin 4). Ad esempio, gli elettrodi possono essere prevenuto verso registrazione neuroni di output elevata ampiezza in luogo di altre cellule. L'interpretabilità delle registrazioni singola unità è aumentatacombinando registrazioni con altre tecniche, tra cui, ma non limitatamente a, elettrici (ortodromica o antidromica), chimica (ad es iontoforetico o recettore designer) o optogenetic stimolazione 4, inattivazioni neurali temporanee, esami sensomotori 5, le procedure di disconnessione o immunoistochimica 3.
Nel protocollo che segue enumereremo i materiali e le fasi necessarie per impiantare una matrice microconduttori organizzata nel ratto (anche se il protocollo può essere adattato per l'uso in altre specie). Il procedimento e lo stile di array fissi utilizzati nel nostro laboratorio hanno dimostrato affidabile per registrazioni longitudinali e possono sostenere registrazioni della stessa neurone nel tempo per un mese 6-8. Ciò rende questa procedura ideale per l'esame delle risposte fasiche agli stimoli sperimentali, i cambiamenti plastici in risposte neurali, o meccanismi di apprendimento e motivazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Registrazioni extracellulari rappresentano una potente tecnica sperimentale che può essere incorporato in quasi ogni preparazione sperimentale nel campo delle neuroscienze. Fili che sono stati impiantati in array organizzati possono essere seguiti come i loro alberi passano attraverso il cervello e nella loro regione di destinazione (Figura 5A). Quando una piccola lesione post-sperimentale viene creato sulla punta microconduttori noninsulated per creare un piccolo deposito ferro dal filo di acciaio ino…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal National Institute on Drug Abuse concede DA 006.886 (MOW) e DA 032.270 (DJB).
Materials
| Table 1. List of Surgical Materials | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Skrews | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 |
| Table 2. List of Surgical Instruments | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann & Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann & Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann & Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann & Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann & Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann & Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann & Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x # 22 Scalpel blade | George Tiemann & Co. | # 160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann & Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| (Part No. Based on array characteristics) | |||
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (& Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter & Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
References
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