في المختبر الهجرة الخليوي والغزو فحوصات
Summary
تستخدم عادة، يتم وصف طرق للوصول للغاية لدراسة الهجرة الخلية والغزو في المختبر. الأسلوب الأول هو الجرح خلية إغلاق الفحص الذي يقيس حركية الخلية. الأسلوب الثاني هو transwell الهجرة والغزو الفحص أن يقيم الكيميائي والقدرة الغازية من الخلايا.
Abstract
Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.
Introduction
حركية هو سمة أساسية من سمات الخلايا الحية. وتشارك الهجرة خلية في مفهوم الحياة، والتطور الجنيني، الاستجابة المناعية، والعديد من العمليات المرضية مثل السرطان والتهاب ثانوي لورم خبيث 1-9. وبالتالي، وأساليب لدراسة الخلية السلوك المهاجرة هي أدوات البحث مفيد جدا لمجموعة واسعة من التخصصات في العلوم الطبية الحيوية، وعلم الأحياء، والهندسة الحيوية، والمجالات ذات الصلة.
دراسة الهجرة الخلية في أبحاث السرطان هو من مصلحة خاصة فيما يرتبط السبب الرئيسي للوفاة في مرضى السرطان لتطور النقيلي. من أجل السرطانية تنتشر وتنشر في جميع أنحاء الجسم، يجب أن تهاجر الخلايا السرطانية وغزو من خلال المصفوفة خارج الخلية (ECM)، intravasate في الدورة الدموية، ونعلق على موقع بعيد، وأخيرا يتسرب إلى تشكيل بؤر بعيدة 1،10-12. لذا يمكن استخدام الأساليب البيولوجية المختلفة لدراسة هذه الأحداث بالتفصيل. ثقافة الخلية جرح إغلاق لوتستخدم على نطاق واسع د هجرة transwell والمقايسات الغزو في الأوساط العلمية 1،10. هذه الاختبارات يمكن أن توفر البيانات اللازمة التي قد تسمح لفهم مدى نوع خلية معينة يمكن ترحيل من تلقاء أنفسهم أو الرد على الكيماوي جاذبة وتهاجر إتجاهي نحو ذلك. وقد وصفت العديد من الظواهر المهاجرة. قد تهاجر الخلايا في شكل خلية واحدة من هذا القبيل كما رأينا في الوسيطة أو حركة تشبه حركة أميبية أو متعددة الخلايا وصفت الهجرة الجماعية أو خلية تدفق 13. طريقة الحركة المستخدمة في خلايا متحركة يمكن ملاحظتها بسهولة باستخدام زراعة الخلايا إغلاق الجرح الفحص.
من بين العديد من الطرق لدراسة الهجرة الخلية، الجرح خلية إغلاق الفحص هو واحد من أبسط. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد القدرة هجرة الجماهير خلية كاملة. عندما اتخذت خطوة أخرى يمكن استخدامها لمراقبة الخصائص المورفولوجية خلية الفرد أثناء الترحيل 14. بعد تحليل إغلاق الجرح قد كشفت العديد من الظواهر. قياس المسافة المغلقة مع مرور الوقت عند مقارنة إلى عنصر تحكم قد تكشف عن تغييرات محددة الهجرة أو النمط الظاهري المهاجرة ضعاف التي لم تكن معروفة سابقا. علاوة على ذلك، تشكيل واحد قدم صفاحية خلية، وذيل سحب، وحركة الاتجاه قد تعطي مؤشرات لما قد تنخفض قيمتها أو محسنة في خلايا الفائدة 14.
هجرة transwell والمقايسات الغزو يمكن أن تستخدم لتحليل قدرة الخلايا واحد للرد إتجاهي لمختلف الكيماوي جاذبة سواء كانوا كيموكينات، عوامل النمو، والدهون، أو النيوكليوتيدات 4،5،8،15،16. كما أنه قد تقييم قدرة المهاجرة الفرق بسبب الإفراط في التعبير عن مستقبلات 1،14. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقايسات لتحديد وتوصيف المنظمين الرئيسيين للهجرة الخلية مثل الأسرة رو من GTPases الصغيرة 2. بعد هذه قصيرة وبسهولة القويمكن أيضا تحديد اختبارات إيصال خدمات الإيداع، ووضع الهجرة الخلية، وقدرة الخلية لغزو في مصفوفة 3-D.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة الخلية هو أحد الجوانب الهامة للدراسة في أبحاث السرطان، ويمكن أيضا أن تطبق على النمو، والجرح الدراسات المناعية الشفاء. ثقافة الخلية الجرح إغلاق الفحص والكشف عن الهجرة الخلية transwell والغزو المقايسات معلومات مفصلة من السلوكيات الخلايا المهاجرة، ويمكن استخدامها…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia & Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
