온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록
Summary
이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
이전 성인 제브라 피쉬의 전기 생리학 연구는 준비 또는 아이 컵 준비 및 electrorentinogram 녹음에 슬라이스를 제한되었습니다. 이 논문은 신경 활동의 기록을 허용, 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 성인의 고정화는 구강 및 아가미 운동 대신 아가미로 용존 산소를 전달하는 메커니즘이 필요합니다. 우리의 기술로, 동물을 고정하고이 요구 사항을 충족하기 위해 서식지 물을 관류. 개두술은 tricaine 메탄하에 수행된다 (MS-222; tricaine) 마취는 뇌에 대한 액세스를 제공하기 위해. 주 전극이어서 세포 뇌 활동을 기록 개두 윈도우 내에 위치된다. multitube 관류 시스템의 사용을 통해, 약물 화합물의 다양한 신경 활동에 성어 및 변경에 투여 될 수있다관찰 할 수있다. 방법론은 신경 활동의 변화에 대하여 만들어 질 관측을 허용 할뿐만 아니라 비교는 유충 및 성인 zebrafish의 사이는 것이 또한 허용한다. 이는 연구자에게 인해 상이한 수명 단계에서의 다양한 화합물의 도입에 신경 활동의 변화를 식별 할 수있는 능력을 준다.
Introduction
이 글에서, 프로토콜은 성인 제브라 피쉬의 신경 활동의 생체 내 녹음에 얻기위한 설명되어 있습니다. 세포 외 기록 방법은 신경 조직의 소 영역 내의 전기적 활동의 전압 측정을 제공하는 데 사용된다. 조사의이 방법은 동물 행동 하나에 다수의 셀을 모니터링하는 것을 포함한다. 이전 슬라이스 녹음은 아이 컵 준비 및 전위도 녹음이로, 성인과 유충 모두에서 수행되었다. 이 실험은 대부분 다양한 감각 시스템 2-5의 생리적 반응은 세부 사항을 수행하고 있습니다. 최근까지 그대로 뇌의 준비는 호흡과 산소 확산이 피부를 통해 발생할 수있는 제브라 피쉬의 유충 3,6,7,와 전기 생리학을 수행 할 수 있었다. 우리의 준비는 동물이 O를 완전히 의식과 인식 남아있는 동안 성인 제브라 피쉬의 기본 신경 활동을 측정 할 수 있습니다F 그 주변.
제브라 피쉬 (다니오 rerio)는 현재, 유전 독성, 약물 및 physiopathological 연구 3에 대한 모델로 기본적인 역할을한다. 그들은 유전, 신경 및 내분비 레벨 8의 포유 동물과 광범위한 동성을 공유하고 있기 때문에, 제브라 피쉬의 신경 과학 분야 내에서 가시성을 얻고있다. 지난 10 년간 표준 neuroanatomic과 면역 조직 화학 기술은 제브라 피쉬의 신경 9-12의 다른 신경 전달 물질 3,8,13의 분포의 상세한 특성 조직을 결정하는 데 사용되었다. 최근 연구자들은 행동 프로세스 16-19 감각 시스템 2,13,20의 전기 생리학 특성을 중심으로 많은 중 기능 연구 (14, 15), 자신의 포커스를 이동했다. 이러한 연구의 소수 Adul 5의 특정 영역의 전기적 활성도에 집중했다제브라 피쉬 뇌 21-23 톤 있지만 생체 내 접근법을 사용하여 수행되지 않았다.
이 프로토콜은 특정 뇌 영역에서 활동의 패턴을 설명하기 위해 제브라 신경계 내의 모두 자발적이고 유발 활성의 전기 생리학 연구에 적용 할 수있다. 이 기술의 사용은 비교가 젊은 유생 단계와 성인의 신경 활동 사이에 할 수 있습니다. 또한, 우리의 프로토콜은 유전자 또는 약물 학적 변화 사이의 비교를 허용합니다. 함께 같은 유전 공학 또는 약물 테스트와 같은 다른 접근 방법으로,이 방법은 늦게 발병 간질이나 신경 퇴행성 과정을 공부하는 등의 잠재적 인 응용 프로그램에 대한 신경 세포의 통신 및 소성 그대로 동물 성인뿐만 아니라의 기능 분석을위한 새로운 가능성을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 생체 내 성인 지브라 피쉬의 신경 활동을 측정하는 데 사용되었다. 기록 된 활동의 특성 (진폭 및 이벤트의 모양) 개별 물고기에 따라 다를 수 있지만 연습으로, 신경 활동은 지속적으로 관찰 할 수있다. 세포 녹음 기술의 활용이 관찰을 설명 할 수 있습니다. 상기 방법은 제 1 지역 내의 다수의 셀의 동시 모니터링을 제공하므로 주 전극의 위치에서의 변화는 관찰 활?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 (TMD, JDL 및 ATS에) NIH / NINDS 부여 R01NS070159에 의해 지원되었다.
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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