Dette papir beskriver, hvordan en voksen zebrafisk kan immobiliseres, intuberet og anvendes til in vivo elektrofysiologiske eksperimenter for at tillade optagelser og manipulation af neural aktivitet i et intakt dyr.
Tidligere har elektrofysiologiske studier i voksne zebrafisk været begrænset til at skære præparater eller til øje kop præparater og electrorentinogram optagelser. Dette papir beskriver, hvordan en voksen zebrafisk kan immobiliseres, intuberet og anvendes til in vivo elektrofysiologiske eksperimenter, som muliggør optagelse af neural aktivitet. Immobilisering af den voksne kræver en mekanisme med opløst oxygen til gæller i stedet for buccal og opercular bevægelse. Med vores teknik er dyr immobiliseres og perfunderet med habitat vand for at opfylde dette krav. En craniotomy udføres under tricaine methanesulfonate (MS-222, tricaine) anæstesi til at give adgang til hjernen. Den primære elektrode er derefter anbragt i kraniotomi vinduet til at optage ekstracellulære hjerneaktivitet. Gennem brug af en multitube perfusion system, kan en bred vifte af farmakologiske forbindelser administreres til voksne fisk, og eventuelle ændringer i neural aktivitetkan iagttages. Den metode ikke kun mulighed for observationer, der skal foretages om ændringer i neurologisk aktivitet, men det giver også mulighed for at foretage sammenligninger mellem larve og voksen zebrafisk. Dette giver forskerne mulighed for at identificere de ændringer i neurologisk aktivitet på grund af indførelsen af forskellige forbindelser ved forskellige livsfaser.
I denne artikel er en protokol, der er beskrevet for at opnå in vivo optagelser af neurale aktivitet i voksen zebrafisk. Anvendes ekstracellulære optagelse metoder, som giver spænding målinger af elektrisk aktivitet inden for et lille område af nervevæv. Denne undersøgelsesmetode involverer overvågning af et stort antal celler i en opfører dyr 1. Tidligere har slice optagelser udført i både voksne og larver, som har øje kop præparater og elektroretinogrammet optagelser. Disse eksperimenter er stort set blevet udført til detaljer fysiologiske reaktioner af forskellige sansesystemer 2-5. Indtil for nylig har intakte hjerne præparater kun været til rådighed til udførelse af elektrofysiologi med zebrafisk larve 3,6,7, hvor respiration og oxygendiffusion kan forekomme gennem huden. Vores forberedelse giver den indfødte neurologiske aktivitet en voksen zebrafisk, der skal måles, mens dyret stadig er ved fuld bevidsthed og bevidst of dens omgivelser.
Zebrafisk (Danio rerio) aktuelt spiller en fundamental rolle som model for genetiske, toksikologiske, farmakologiske og fysiopatologiske undersøgelse 3. Zebrafisk har fået synlighed inden for neuroscience, fordi de deler omfattende homologi med pattedyr ved de genetiske, neurale og endokrine niveauer 8. Gennem det seneste årti, har standard neuroanatomisk og immunhistokemiske teknikker blevet brugt til at fastlægge det detaljerede karakteristisk organisering af zebrafisk nervesystem 9-12 og af fordelingen af forskellige neurotransmittere 3,8,13. For nylig har forskere flyttet deres fokus til funktionelle studier 14,15, hvoraf mange centrum på adfærdsmæssige processer 16-19 og elektrofysiologiske karakteristika sansesystemer 2,13,20. Et lille antal af disse undersøgelser har koncentreret sig om den elektriske aktivitet i specifikke områder af adult zebrafisk hjerne 21-23, men ikke blev gennemført ved hjælp af en in vivo-tilgang.
Denne protokol kan tilpasses til elektrofysiologiske undersøgelser af både spontane og fremkaldte aktivitet inden zebrafisk nervesystem til at beskrive mønstre af aktivitet i bestemte områder af hjernen. Brugen af denne teknik gør det muligt at foretage sammenligninger mellem den neurologiske aktivitet af unge larvestadier og voksne. Endvidere vores protokol tillader sammenligninger mellem genetiske eller farmakologiske ændringer. Sammen med andre metoder, såsom genteknologi eller farmakologiske forsøg, denne metode giver en ny mulighed for funktionel analyse af neuronal kommunikation og plasticitet i den intakte voksent dyr samt for potentielle applikationer, såsom at studere sen debut epilepsi eller neurodegenerative processer.
Denne protokol er blevet anvendt til at måle den neurale aktivitet af voksne zebrafisk in vivo. Med praksis, kan neurale aktivitet observeres konsekvent, selvom karakteristika (amplitude og form af hændelser) af den optagne aktivitet kan variere mellem de enkelte fisk. Udnyttelse af den ekstracellulære optagelse teknik kan forklare denne observation. Fremgangsmåden giver samtidig overvågning af et stort antal celler i en region 1, så variationer i positionen af den primære elektrode kan spille…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH / NINDS Grant R01NS070159 (til TMD, JDL og ATS).
70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
Sponge | Small pore and chemical-free | ||
Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
9 V Battery | |||
Wires with alligator clips | Need 2 | ||
37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
1/8 in diameter tube | |||
1 cm diameter tube | |||
1 mm diameter tube | |||
Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
3-way Stopcocks with Luer connections | |||
1-way Stopcock with Luer connection | |||
Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
Axoclamp software | Molecular Devices | ||
HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
10 ml Luer lock syringe | |||
1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
Microsoft-based PC | Dell | ||
Faraday Cage | |||
Air Table | |||
Dissecting Microscope |