使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em>体外</em>接着アッセイ
Summary
インビトロでの付着アッセイは、細胞単層上皮するような肺炎球菌のコロニー形成を阻害するためのプロバイオティクスの使用のような潜在的な介入を調査するために、肺炎連鎖球菌の付着を研究するために使用することができる。
Abstract
鼻咽頭の上皮層への肺炎球菌 （肺炎球菌）の付着が植民地になることができます。 インビトロ接着アッセイは、細胞上皮する肺炎球菌の付着を研究するために使用することができ、肺炎や中耳炎などの肺炎球菌感染症のための前提条件と考えられている単層および、そのようなプロバイオティクスの使用など電位介入を調査するために、肺炎球菌のコロニー形成を阻害すること。ここで説明するプロトコルは、（時にはHEp-2細胞とも呼ばれる）は、ヒト上皮細胞株CCL-23への肺炎球菌の付着に対するプロバイオティックストレプトコッカス·サリバリウスの効果を調査するために使用される。上皮細胞および細菌細胞の1）準備、細胞単層上皮への細菌の2）に加え、3）生菌数（段階希釈およびプレーティング）による接着性の肺炎球菌の検出または定量的リアルタイムPCR（定量PCR：アッセイは、3つの主要な手順が含まれます）。このTEChniqueは比較的簡単であり、組織培養のセットアップ以外の特殊な装置を必要としません。このアッセイは、他のプロバイオティック種および/または肺炎球菌のコロニー形成の潜在的な阻害剤を試験するために使用することができ、容易に肺炎球菌の付着および侵入に関する他の科学的問題に対処するために修飾することができる。
Introduction
肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、肺炎、中耳炎、髄膜炎などの感染症を引き起こす可能性グラム陽性細菌である。これは、低所得国の子供たちと、毎年1 5歳未満の子供の推定80万死亡の原因の病気の主要な原因である。肺炎球菌は、しばしば幼児の鼻咽頭に運ばれる。この植民地は一般的に無症候性と考えられていますが、肺炎球菌感染症に先行し、ヒト集団2中の細菌のための貯蔵所として機能します。肺炎球菌共役ワクチン接種は、効果的なワクチン内に含まれる血清型のキャリッジを低減します。しかし、そこに90以上の肺炎球菌血清型があり、ワクチン接種はワクチン血清型の排除がnonvaccine血清型3に起因するキャリッジと病気の上昇が続いていることにより、血清型の交換、につながることができます。また、一部の高リスク集団において、肺炎球菌植民地化は、多くの場合、前に最初のワクチン用量4,5の投与と、非常に人生の早い段階で発生します。最近では、プロバイオティクスの使用は、肺炎球菌のコロニー形成を阻害する6,7 –付加的な戦略として提案されている。 インビトロ付着アッセイは、肺炎球菌付着8,9を調べるために使用されてきた。これらのアッセイは、肺炎球菌付着10上のプロバイオティックラクトバチルス·ラムノサス GG（LGG）の影響を調査するために適応されている。
LGGおよび他の乳酸菌に加えて、 ストレプトコッカス·サリバリウス 、口腔の一般的な居住者は、潜在的なインビトロおよび11 に肺炎球菌および他の呼吸器病原体を阻害する能力のコロニー形成への気道のための潜在的なプロバイオティクスとして研究されている– 13。ここで紹介するプロトコルは、S.の効果を調査するために使用される接着アッセイを記載肺炎球菌付着に対するサリバリウス K12ヒト上皮細胞株CCL-23へ。成長および付着特性は単離物10,14間で実質的に変化し得るように、アッセイで使用する前に、肺炎球菌分離株は、付着力を評価した。肺炎球菌やブドウの成長曲線サリバリウスを、光学密度（OD、 図1）（コロニー形成単位またはCFU / ml）を中間対数相と推定濃度を決定した。それは、それぞれのアッセイで使用する前に隔離するための生菌数とODにより成長を調べることをお勧めします。このアッセイは、標準的な組織培養施設及び設備を有する任意の実験室で行うことができる。このプロトコルでは、S.の3用量の効果サリバリウス前Sの付着に対する肺炎球菌のほかに1時間投与肺炎球菌 PMP843、鼻咽頭スワブから派生した血清型19Fキャリッジ分離株は、検査されます。付着性肺炎球菌を定量化するには、2つの異なる方法が提示されています。抑止する血液寒天上で平板鉱山生菌数、およびDNA抽出および定量PCRによる肺炎球菌15 LYTA遺伝子の検出。基本的な接着アッセイプロトコルは容易に異なる用量又はプロバイオティクスの投与時間を試験するために修飾することができ、また、他の細菌株又は種を用いることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このアッセイの重要な部分は、Sの適切な濃度を追加していますのセクション3.1.7と3.1.12でのサリバリウスと肺炎球菌。濃度をOD測定値を用いて推定しているが、プレートを次の日にカウントされるまで正確な接種物が決定されていません。この理由から、我々は、対数中期を識別し、ODによって濃度を推定するのを補助するためのアッセイで使用されるすべての細菌株についての…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、マードック子供研究所、ビクトリア州政府の業務インフラ支援プログラムからの資金によってサポートされていました。
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
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