使用一个调查益生素对肺炎球菌定植的影响<em>体外</em>粘附试验
Summary
体外坚持测定可用于研究肺炎链球菌的附着上皮细胞单层，并探讨潜在的干预措施，如使用益生菌抑制肺炎球菌定植。
Abstract
肺炎链球菌 （肺炎球菌）的坚持鼻咽上皮衬里可导致殖民化，被认为是肺炎球菌感染，如肺炎和中耳炎的先决条件。 体外粘附实验可以用来研究肺炎球菌的附着上皮细胞单层和调查潜在的干预措施，如使用益生菌，能抑制肺炎球菌定植。这里所描述的协议被用来研究对肺炎球菌的对人上皮细胞系CCL-23的粘附益生菌唾液链球菌的效果（有时也称为HEp-2细胞）。该法包括三个主要步骤：1）准备上皮细胞和细菌细胞，2）除细菌上皮细胞单层的，和3）检测肺炎链球菌粘附通过活菌数（连续稀释和电镀）或定量实时PCR（qPCR的）。这TEChnique是相对简单的，不需要专门的设备比组织培养的设置等。该法可用于测试其他益生菌种类和/或肺炎球菌定植的潜在抑制剂，并可以很容易地修改，以解决有关肺炎球菌粘附和侵袭等科学问题。
Introduction
肺炎链球菌 （肺炎球菌）是一种革兰氏阳性细菌，可引起感染，包括肺炎，中耳炎，脑膜炎。它是疾病的中低收入国家的儿童和负责估计有80万，每年死亡人数的1五岁以下儿童的主要病因。肺炎球菌是经常携带在幼儿的鼻咽部。虽然这定植通常被认为是无症状的，它先于肺炎球菌的感染，并作为贮存器为细菌在人群2。肺炎球菌结合疫苗接种有效地降低了运输包含在疫苗中的血清型。然而，有超过90肺炎球菌血清型，疫苗接种可导致血清型替换，从而消除疫苗血清型的后面是一个上升的马车和疾病引起的非疫苗血清型3。此外，在一些高危人群，肺炎球菌定植常发生在生命的早期，前第一剂疫苗4,5的管理。最近，使用益生菌已被提出作为一个额外的策略，以抑制肺炎球菌定植6,7。 体外粘附试验已被用于检查肺炎球菌粘附8,9。这些实验已经适应了调查益生菌鼠李糖乳杆菌 GG（LGG）对肺炎球菌坚持10的影响。
除了LGG和其他乳酸细菌， 唾液链球菌 ，口腔内的一种常见的居民，已被研究作为呼吸道一个潜在的益生菌，由于其潜在的定殖和抑制肺炎球菌和其它呼吸道病原体的体外能力11 – 13。这里介绍的协议描述用于调查S的影响的粘附试验唾液 K12对肺炎球菌坚持对人上皮细胞系CCL-23。在之前的实验使用，肺炎球菌菌株进行了评价粘附能力，生长和附着性可以有很大差异的菌株10,14之间。肺炎链球菌和S.的生长曲线唾液中执行通过光密度，以确定对数中期和估计浓度（菌落形成单位或CFU /毫升）（OD， 图1）。因此建议通过活菌数和OD检查生长的每个隔离在测定前使用。该测定可以在标准的组织培养设施和设备的任何实验室进行。在这个协议中，三个剂量的S的影响唾液给予1小时前对S的依从性增加肺炎球菌肺炎 PMP843，从鼻咽拭子派生的血清型19F车厢分离，进行检查。两种不同的方法来量化肺炎链球菌粘附呈现：电镀血琼脂阻止矿山活菌数，以及DNA提取和检测肺炎链球菌自溶素基因的qPCR 15。基本遵守试验方案可以很容易地修改，以测试不同剂量或益生菌的给药时间，也可以与其他的细菌菌株或物种中使用。
Protocol
Representative Results
Discussion
该测定法的一个关键部分是加入S的适当浓度唾液和肺炎球菌在第3.1.7和3.1.12。浓度使用OD值估计，但确切的接种都没有确定，直到板计数第二天。出于这个原因，建议进行生长曲线测定OD和活菌数（CFU / ml）的随时间变化的测定中用于识别数中期，并协助由OD浓度估算所有的菌株。此外，肺炎球菌菌株可以在自己的坚持性方面都有很大差别。菌株具有良好的粘附性（>接种3小时温育之…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由来自默多克儿童研究所和维多利亚州政府的基础设施运营支持项目资金支持。
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
References
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