من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي
Summary
تقدم هذه الورقة خطوة خطوة الدليل لأسلوب تحليل تذبذب ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) لقياس معاملات نشر fluorescently المسمى غشاء بروتينات البلازما في خلايا الثدييات الحية.
Abstract
وينظم انتشار الأفقي وتجزئة بروتينات غشاء البلازما بإحكام في الخلايا، وبالتالي، ودراسة هذه العمليات سوف تكشف عن رؤى جديدة لغشاء البلازما وظيفة البروتين والتنظيم. مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) وقد وضعت 1 لتمكين القياسات الروتينية للمعاملات نشرها مباشرة من صور الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما، التي تجنب التحيز المنهجي الذي عرضته photophysics التحقيق. على الرغم من أن الأساس النظري لتحليل معقد، وطريقة يمكن تنفيذها من قبل nonexperts باستخدام رمز متاحة بحرية لقياس معاملات نشر من البروتينات. KICS بحساب دالة الارتباط الوقت من صورة كومة مضان المجهري بعد فورييه تحويل كل صورة إلى المتبادلة (ك) الفضاء. في وقت لاحق، في المتوسط دائرية، اللوغاريتم الطبيعي وتحويل الخطية يناسب إلى وظيفة ارتباط تعطي معامل الانتشار. هذاوتوفر ورقة دليل خطوة بخطوة لتحليل الصورة وقياس معاملات الانتشار عبر KICS.
أولا، يتم الحصول على ارتفاع معدل الإطار تسلسل الصور من البلازما بروتين الغشاء fluorescently المسمى باستخدام المجهر مضان. ثم، يتم تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) تجنب عضيات داخل الخلايا، والانتقال حويصلات أو جاحظ مناطق الغشاء. يتم استيراد المكدس العائد على الاستثمار في مدونة متاحة بحرية ويتم تعيين العديد من المعلمات تحديدا (انظر القسم الطريقة) لتحليل KICS. البرنامج ثم يقوم بإنشاء "المنحدر من المنحدرات" مؤامرة من وظائف الارتباط الوقت ك الفضاء، ويتم حساب معامل الانتشار من المنحدر من المؤامرة. وفيما يلي الإجراء خطوة بخطوة KICS لقياس معامل الانتشار من بروتين الغشاء باستخدام الكلوي قناة المياه aquaporin-3 المفتاحية EGFP كمثال الكنسي.
Introduction
تنظم المنظمة الزمانية المكانية أربعة الأبعاد والتنقل الجانبي للبروتينات غشاء البلازما بإحكام ويمكن أن تلعب دورا في وظيفة البروتين والنشاط والتفاعل البروتين البروتين. الانتشار الأفقي للبروتينات غشاء البلازما، وقد جرت العادة على درس عن طريق حساب معاملات نشر للجسيمات واحدة من الوقت الفاصل بين التصوير من الكم نقطة أو صبغ المسمى غشاء بروتينات البلازما 2-4. هذا النهج يتطلب إدخال علامة خارج الخلية البروتين في غشاء البلازما لالكم نقطة أو وضع العلامات الصبغة، والتي يمكن أن تمس للطي البروتين وظيفة، وبالتالي، لا يمكن أن يتحقق لبعض البروتينات. وقد تبين حجم الفراغية من الكم نقطة لإبطاء انتشار البروتين 5 وعلاوة على ذلك، وصفت سوى نسبة ضئيلة من البروتينات في عدد السكان مع نقاط الكم، وليس من المعروف ما إذا كان هذا الكسر هو ممثل لمجموع مجموعة من البروتينات غشاء البلازما. هيئة تنظيم الاتصالات جسيم واحدcking يبدو (SPT) قياسات معاملات نشر سلسلة من الصور من الكم نقطة البروتينات المسمى ينطوي على تعيين المناصب ذروة تصوير الجزيئات مع اثنين من الأبعاد التمويه يناسب تليها خوارزميات التحليل واسعة النطاق. التحليل هو حسابيا مكثفة للغاية، وتتطلب منحنى غير الخطية واسعة النطاق المناسب في كل إطار صورة تسلسل الوقت الفاصل بين لتقريب وظيفة انتشار نقطة المجهر (عادة اثنين من الأبعاد المكانية Gaussians) وربط لاحقة من المناصب الجسيمات في مسارات الجسيمات التي تصف حركة الجزيئات واحدة 6،7.
صورة تقنية الترابط وضعت مؤخرا، ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي (KICS) تمكن قياسات بسيطة النسبية للمعاملات نشر الموسومة fluorescently البروتينات غشاء البلازما. إمكانية لحساب معاملات روتينية نشر بروتينات الغشاء المسمى مع البروتينات الفلورية التي كتبها KICS هو أداة فريدة من نوعها التي تتولىالعديد من المزايا التقليدية الكم دوت تحليل SPT: لا يلزم من الأكواد الإدراج خارج الخلية وقتا طويلا خارج الخلية وضع العلامات (خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية يمكن استخدامها)؛ يتم استخراج معاملات نشر من تجمع مجموعه من البروتينات الفلورية مقارنة فرعية المسمى مع نقاط الكم؛ تحليل بسيط دون الحاجة إلى تتبع البروتينات واحد ويمكن إجراء التحليل باستخدام التعليمات البرمجية الموجودة مع عدم وجود شرط للبرمجة مستخدم إضافي. هذه الطريقة السريعة لأنه هو أسلوب المتوسط والتي تمكن بسرعة حساب وحساب معاملات نشر. هذه القياسات الانتشار السريع للسكان البروتين تكمل المعلومات أكثر تفصيلا النقل الجزيئية التي تم الحصول عليها عن مجموعة فرعية من السكان وفقا للأساليب SPT مضنية.
الوقت KICS يرتبط تسلسلات الصور مضان المجهر الأولى التي تحولت إلى فورييه الفضاء، وبالتالي يفصل فلوريداتقلبات uorescence بسبب photophysics من تلك التي تعزى إلى النقل الجزيئية 1. ونتيجة لذلك، يمكن KICS تحديد كثافة العدد، سرعة التدفق، ونشر fluorescently المسمى الجزيئات في حين يجري غير متحيز من قبل photobleaching من معقدة أو امض من fluorophores. وهذا يجعل KICS أداة مفيدة لتحديد بسرعة ديناميات نشر بروتينات غشاء الخلية fluorescently المسمى من دون الحاجة إلى كتابة الخوارزميات مخصص. إلى جانب البروتينات fluorescently المسمى، KICS يمكن أيضا أن تطبق على الكم دوت المسمى غشاء بروتينات 8.
تقدم هذه الورقة مقدمة خطوة بخطوة لكيفية استخدام KICS لاستخراج معاملات نشر EGFP الموسومة البروتينات غشاء البلازما من خلال إظهار كيفية وضع المحصول، وكيفية استخدام رمز وكيفية تقييم المؤامرات ولدت، الذي نشر يتم استخراج معاملات. على سبيل المثال، البيانات التي حصلت عليها الغزل مجموعة القرص المجهري في شبه الانعكاس الداخلي الكامل يتألقيتم تقديم الامتحانات التنافسية الوطنية (TIRF) واسطة، من البروتين الكلى قناة المياه aquaporin-3 (AQP3) الموسومة مع EGFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
قدمت هذه الورقة خطوة بخطوة محة مفصلة عن كيفية تطبيق أسلوب التحليل KICS لتحديد معاملات نشر من صور المجهر من البروتينات ذات الكلمات الدلالية مع البروتينات الفلورية. تحليل مستقل عن التحقيق مع اختيار مجموعة ديناميكية واسعة جدا في كثافة وضع العلامات وبالتالي يمكن أن تطبق ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل زمالة وندبيك ليدر جروب جديد لLNN. يقر PWW دعم التمويل منحة من العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC). كما نشكر المركز الدانمركي الجزيئية Bioimaging في جامعة جنوب الدنمارك للوصول إلى القرص الغزل المجهر.
Materials
References
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
