La evaluación de cambios en la volátil Anestésico general La sensibilidad de los ratones después de la intervención farmacológica local o sistémica
Summary
La pérdida del reflejo de enderezamiento ha servido durante mucho tiempo como un sustituto de comportamiento estándar para la pérdida del conocimiento, también llamada la hipnosis, en animales de laboratorio. Las alteraciones en la sensibilidad anestésico volátil causadas por las intervenciones farmacológicas pueden ser detectados con un sistema de evaluación de alto rendimiento cuidadosamente controlado, que puede adaptarse para la entrega de cualquier terapéutica inhalada.
Abstract
Un punto final deseable de la anestesia general es el estado de inconsciencia, también conocida como la hipnosis. Definir el estado hipnótico en los animales es menos sencillo de lo que es en pacientes humanos. Un sustituto de comportamiento ampliamente utilizado para la hipnosis en roedores es la pérdida del reflejo de enderezamiento (LORR), o el punto en el que el animal ya no responde a su instinto innato para evitar la vulnerabilidad de decúbito dorsal. Hemos desarrollado un sistema para evaluar LORR en 24 ratones, mientras que al mismo tiempo cuidadosamente de controlar por factores de confusión potenciales, incluyendo fluctuaciones de temperatura y diferentes flujos de gas. Estas cámaras permiten una evaluación fiable de la anestesia la sensibilidad, medido por la latencia para volver del reflejo de enderezamiento (RORR) después de una exposición al anestésico fijo. Alternativamente, usando los aumentos paso a paso (o disminuye) en la concentración de anestésico, las cámaras también permiten la determinación de la sensibilidad de una población a la inducción (o la emergencia) según lo medido porCE 50 y pendiente de Hill. Finalmente, las cámaras ambientales controladas descritos aquí pueden adaptarse para una variedad de usos alternativos, incluyendo la entrega inhalado de otros fármacos, estudios de toxicología, y la monitorización simultánea en tiempo real de los signos vitales.
Introduction
La anestesia general se definen por su capacidad de causar un estado reversible de la hipnosis en una amplia variedad de especies, sin embargo, una explicación de cómo una clase tan diverso de drogas puede provocar todo un criterio de valoración singular sigue siendo difícil de alcanzar. Un número de teorías se han postulado largo de los años, a partir de la correlación de Meyer-Overton entre la potencia anestésica y solubilidad en lípidos, que sugirió interrupciones general de membrana como la base para el 1,2 hipnosis. La evidencia más reciente sugiere que los objetivos de proteínas que afectan a la señalización neuronal contribuyen a los efectos anestésicos. Los ratones han demostrado ser un modelo indispensable para la exploración de estas teorías debido a la homología entre murino y capacidad de respuesta anestésico humano. Aunque un ratón no puede ser preguntado por su conciencia subjetiva, bajo anestesia general, ciertos reflejos primitivos sirven medidas de sustitución como útiles de la hipnosis de los roedores. En los primeros días después del nacimiento, los ratones desarrollan una resp enderezamiento reflexivaOnse que éstos no pueden ser colocados de forma pasiva en una posición supina 3. La dosis de la anestesia en la que un ratón pierde su reflejo de enderezamiento se correlaciona bien con dosis hipnóticas humanos 4.
Evaluación de la pérdida de reflejo de enderezamiento (LORR) se ha convertido en un estándar de laboratorio ampliamente utilizado para las pruebas de sensibilidad anestésica en ratones, así como una variedad de otras especies, incluyendo rata, cobaya, conejo, hurón, ovejas, perro y 5-8. La dosis de un anestésico que se da en la que LORR se producirá para los miembros de una especie es extremadamente consistente, pero puede ser desplazado significativamente por factores ambientales. Por ejemplo, las ratas privadas de sueño son más sensibles tanto a los anestésicos volátiles e intravenosos 9 y ratas con alta capacidad aeróbica son menos sensibles a isoflurano 10. La hipotermia también se ha demostrado que disminuye la dosis de numerosos anestésicos necesarios para la hipnosis en un gran espectro de especies de 11-14. En ordenpara identificar de forma fiable la dosis de anestésico en el que LORR se produce en un grupo de animales experimentales, es crítico que el entorno de evaluación ser controlado cuidadosamente para minimizar el estrés, mantener euthermia, y entregar cantidades iguales de fármaco para todos los sujetos. Como era de esperar, también se conocen los factores genéticos para alterar la sensibilidad anestésica 15-18. En consecuencia, la consideración cuidadosa debe también tener en cuenta el control de los antecedentes genéticos 19.
Hemos desarrollado un aparato que asegura la administración de anestesia gaseosa idéntico a cada uno de 24 ratones, mientras que el mantenimiento de un ambiente constante 37 o C. El diseño cilíndrico transparente de nuestras cámaras de exposición permite una evaluación LORR rápido y fácil integración de las mediciones fisiológicas telemétricos. Este sistema ha sido mostrado para medir con precisión el isoflurano, halotano, y la inducción sevoflurano CE 50 y tiempo de emergencia en ratones de tipo salvaje 20. También hemos utilizadoeste sistema para observar los cambios en la sensibilidad anestésica en ratones con mutaciones genéticas y lesiones hipotalámicas dirigidos 21-23. Aquí se describen dos formas en las que la sensibilidad anestésico puede evaluarse después de una intervención farmacológica utilizando nuestro aparato de ambiente controlado. Fenotipado El estado de equilibrio de la inducción de la anestesia volátil y sensibilidad emergencia requiere 8-10 horas y es en consecuencia la mejor medida para estudios en los que las condiciones experimentales no cambian, como en las intervenciones farmacológicas crónicos o de larga duración. Sin embargo, para los tratamientos de corta acción cuyos efectos disiparse significativamente con el tiempo también presentamos un procedimiento simple para evaluar los cambios en los reflejos de recuperación siguientes microinyecciones estereotácticamente-específicas o tratamientos de drogas intravenosas que impactan significativamente la emergencia anestésico. Estas pruebas representan un pequeño subconjunto de las posibles aplicaciones de este sistema de ambiente controlado, lo que podría ser adaptado para cualquier número de subjECTS de una variedad de especies para recibir cualquier tipo de terapéutica inhalado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque la evaluación de LORR en un solo ratón es una tarea aparentemente sencilla, sin embargo es esencial para mantener las condiciones fisiológicas idénticas entre los sujetos con el fin de recopilar datos fiables a partir de un grupo de animales. El aparato LORR estrictamente regulados, de alta capacidad que aquí se presenta ofrece una manera de estandarizar los experimentos y maximizar la eficiencia. Siguiendo los principios básicos de la termorregulación y la distribución equitativa de flujo, este sistema p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta labor fue apoyada por R01 GM088156 y T32 HL007713-18. Nos gustaría dar las gracias a Bill Pennie y Michael Carman de la Universidad de Pennsylvania Investigación Instrumentación Shop por su ayuda en el montaje de nuestro aparato reflejo de enderezamiento.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung?. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 .
- Overton, C. E. . Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine–midazolam–ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R. Medetomidine sedation in sheep. Zentralblatt für Veterinärmedizin. Reihe A. 40 (5), 328-331 (1993).
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd, ., J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via “hit and run” gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
