Vurdere ændringer i flygtige narkose Følsomhed af mus efter lokale eller systemiske farmakologisk intervention
Summary
Tab af stabilitetsrefleksen har længe fungeret som en standard adfærdsmæssige surrogat for bevidstløshed, også kaldet hypnose, i forsøgsdyr. Ændringer i flygtigt anæstetikum følsomhed forårsaget af farmakologiske midler kan påvises med en nøje kontrolleret high-throughput vurdering system, som kan tilpasses til levering af enhver inhaleret terapeutisk.
Abstract
En ønskelig endpoint af generel anæstesi er den tilstand af bevidstløshed, også kendt som hypnose. Definition af hypnotisk tilstand hos dyr er mindre ligetil end det er i menneskelige patienter. En meget brugt adfærdsmæssige surrogat for hypnose hos gnavere er tabet af stabilitetsrefleks (LORR), eller det sted, hvor dyret ikke længere reagerer på deres medfødte instinkt for at undgå sårbarhed dorsale tilbagelænethed. Vi har udviklet et system til vurdering LORR i 24 mus på samme tid, mens omhyggeligt kontrollere for potentielle confounds, herunder temperatursvingninger og varierende gasstrømme. Disse kamre tillader pålidelig vurdering af bedøvelsesmiddel følsomhed som målt ved latenstid for at vende tilbage til den oprettende refleks (RORR) efter en fast bedøvelsesmiddel eksponering. Alternativt bruge trinvise stigninger (eller fald) i anæstesikoncentrationen, kamrene også muliggøre fastlæggelse af en befolkning følsomhed over for induktion (eller fremkomst) som målt vedEC 50 og Hill skråning. Endelig kan de kontrollerede miljøkamre her beskrevne tilpasses til en bred vifte af alternative anvendelser, herunder inhaleret levering af andre lægemidler, toksikologiske undersøgelser, og samtidig real-time overvågning af vitale tegn.
Introduction
Generel anæstesi er defineret ved deres evne til at forårsage en reversibel tilstand af hypnose i en bred vifte af arter, men en forklaring på, hvordan sådan en forskelligartet klasse af lægemidler kan alle fremkalde en særegen endpoint fortsat undvigende. En række teorier er blevet postuleret i årenes løb, startende med Meyer-Overton sammenhæng mellem bedøvelsesmiddel potens og lipid opløselighed, som foreslog generelle forstyrrelser membran som grundlag for hypnose 1,2. Flere nye oplysninger tyder på, at protein-targets påvirker neuronal signalering bidrager til bedøvende virkninger. Mus har vist sig at være en uundværlig model for at udforske disse teorier på grund af homologi mellem murine og humane bedøvelsesmiddel lydhørhed. Selvom en mus ikke kan blive spurgt om sin subjektive bevidsthed under generel anæstesi, visse primitive reflekser tjene som nyttige surrogat mål for gnaver hypnose. I de første par dage efter fødslen, mus udvikler en refleksiv oprettende hhvonse der forhindrer dem i at blive passivt placeret i rygleje 3. Dosen af anæstesi, hvor en mus mister sin opretningsrefleksen korrelerer godt med humane hypnotiske doser 4.
Vurdering af tab af opretningsrefleks (LORR) er blevet en udbredt standard laboratorium til at teste bedøvelsesmiddel følsomhed i mus såvel som en række andre arter, herunder rotte, marsvin, kanin, fritte, får, hunde og 5-8. Den dosis af en given anæstetisk hvor LORR vil forekomme for medlemmer af en art er yderst ensartet, men det kan forskydes væsentligt af miljøfaktorer. For eksempel søvnmangel rotter er mere følsomme over for både flygtige og intravenøse anæstetika 9 og rotter med høj aerob kapacitet er mindre følsomme over for isofluran 10. Hypotermi er også blevet vist at nedsætte dosis af talrige anæstetika kræves for hypnose i et stort spektrum af arter 11-14. Forpålideligt identificere den bedøvende dosis, hvor LORR optræder i en gruppe af forsøgsdyr, er det afgørende, at vurderingen miljø følges nøje for at minimere stress, vedligeholde euthermia og levere lige mængder af stof til alle fag. Ikke overraskende, er genetiske faktorer også kendt for at ændre bedøvelsesmiddel følsomhed 15-18. Derfor bør omhyggelig overvejelse også vægt på at kontrollere for genetiske baggrund 19.
Vi har udviklet et apparat, der sikrer ens gasformigt anæstetisk levering til hver af 24 mus under opretholdelse af en konstant 37 ° C miljø. Den gennemsigtige cylindriske design af vores eksponering kamre giver mulighed for hurtig LORR vurdering og nem integration af telemetriløsninger fysiologiske målinger. Har vist, at dette system til at måle isofluran, halothan og sevofluran induktion EC 50 og tid til fremkomst i vildtype-mus 20. Vi har også anvendtdette system til at observere ændringer i bedøvelsesmiddel følsomhed i mus med genetiske mutationer og målrettede hypothalamus læsioner 21-23. Her beskriver vi to måder, hvorpå bedøvelsesmiddel sensitivitet kan vurderes efter en farmakologisk intervention ved hjælp af vores apparat kontrolleret miljø. Steady-state fænotypebestemmelse af flygtigt anæstetikum, induktion og fremkomsten følsomhed kræver 8-10 timer og er dermed bedst skræddersyet til undersøgelser, hvor eksperimentelle betingelser ikke ændrer sig, såsom kronisk eller langtidsvirkende farmakologiske interventioner. Men for korttidsvirkende behandlinger, hvis virkninger spreder sig betydeligt over tid, vi også præsentere en simpel procedure til at vurdere ændringer i stabilitetsrefleks efter stereotaktisk målrettede microinjections eller intravenøse lægemiddelbehandlinger, der væsentligt påvirker bedøvelsesmiddel fremkomst. Disse tests udgør en lille delmængde af de potentielle anvendelser for kontrolleret miljø system, som kan tilpasses til en række subjects i en række arter til at modtage alle typer af inhaleret terapeutisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom vurderingen af LORR i en enkelt mus er en tilsyneladende enkel opgave, er det ikke desto mindre vigtigt at opretholde samme fysiologiske forhold mellem fag for at indsamle pålidelige data fra en gruppe af dyr. Den stramt reguleret, høj kapacitet LORR apparat præsenteres her giver en måde at standardisere eksperimenter og maksimere effektiviteten. Ved at følge de grundlæggende principper i varmeregulering og lige flow distribution, kan dette system let genskabt og tilpasses til at passe individuelle ek…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af R01 GM088156 og T32 HL007713-18. Vi vil gerne takke Bill Pennie og Michael Carman fra University of Pennsylvania Research Instrumentering Shop for deres hjælp i at samle vores stabilitetsrefleks apparat.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung?. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 .
- Overton, C. E. . Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine–midazolam–ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R. Medetomidine sedation in sheep. Zentralblatt für Veterinärmedizin. Reihe A. 40 (5), 328-331 (1993).
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd, ., J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via “hit and run” gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
