الاستشعار من الجدار الأنسجة تعطيل مع الترانزستور العضوي الكهروكيميائية
Summary
تم دمج الترانزستور العضوي الكهروكيميائية مع الخلايا الحية وتستخدم لمراقبة تدفق الأيونات عبر حاجز الظهارية المعوية. في هذه الدراسة، وزيادة في تدفق أيون، تتعلق تعطيل منعطفات ضيقة، الناجم عن وجود EGTA خالب الكالسيوم (جلايكول الإثيلين مكرر (الأثير بيتا aminoethyl)-N، N، N '، الخليك N'رباعي حامض)، ويقاس.
Abstract
الجهاز الهضمي هو مثال على حاجز الأنسجة التي توفر حاجز مادي ضد دخول مسببات الأمراض والسموم، في حين يسمح بمرور الأيونات والجزيئات الضرورية. يمكن أن يكون سبب الاختراق في هذا الحاجز عن طريق انخفاض في تركيز الكالسيوم خارج الخلية. هذا الانخفاض في تركيز الكالسيوم يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي في البروتينات المشاركة في الختم من الجدار، مما أدى إلى زيادة في تدفق paracellular. لتقليد هذا التأثير الكالسيوم خالب جلايكول الإثيلين مكرر (الأثير بيتا aminoethyl)-N، N، N '، وكان يستخدم حمض الخليك N'رباعي (EGTA) على أحادي الطبقة من الخلايا المعروف أن ممثل الجهاز الهضمي. أساليب مختلفة للكشف عن اختلال النسيج حاجز موجودة بالفعل، مثل المناعي ونفاذية المقايسات. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت ومكلفة وغير مناسبة لقياسات الحيوية أو الإنتاجية العالية. الوسائل الإلكترونية لقياس الأنسجة حاجزتوجد أيضا النزاهة لقياس المقاومة بطريق الظهارة (TER)، ولكن هذه غالبا ما تكون مكلفة ومعقدة. هناك حاجة لتطوير طرق سريعة، ورخيصة، وحساسة على وجه السرعة كما على سلامة الأنسجة حاجز معلمة رئيسيا في اكتشاف الأدوية ووسائل التشخيص الممرض / السم. وقد تبين الترانزستور الكهروكيميائية العضوية (OECT) تتكامل مع النسيج حاجز تشكيل خلايا كجهاز جديدة قادرة على رصد حيوي سلامة الأنسجة الحاجز. الجهاز قادر على قياس التغيرات الدقيقة في تدفق الأيونية مع القرار الزماني لم يسبق لها مثيل والحساسية، في الوقت الحقيقي، كمؤشر على سلامة الأنسجة الحاجز. ويستند هذا الأسلوب الجديد على جهاز بسيط يمكن أن تكون متوافقة مع التطبيقات فحص إنتاجية عالية وبتكلفة منخفضة ملفقة.
Introduction
ظهارة المعوية هو مثال على حاجز الأنسجة التي تسيطر على مرور الجزيئات بين مقصورات مختلفة من الجسم. يتكون من خلايا ظهارة عمودية ممدود انضم معا عن طريق المجمعات من البروتينات التي توفر حاجزا ضد مسببات الأمراض الجسدية 1 والسموم، في حين يسمح بمرور الماء والمواد الغذائية اللازمة للحفاظ على الجسم. ويرجع ذلك إلى الاستقطاب من الخلايا الظهارية، مما يخلق اثنين من المجالات المختلفة غشاء هذه الانتقائية: الجانب قمية من الخلايا المعرضة لمعة والجانب القاعدية من الخلايا ترتكز على الأنسجة الكامنة 2،3. منعطفات ضيقة (TJ) هي المجمعات من البروتينات الموجودة في الجزء القمي من الخلايا الظهارية والتي هي جزء من مجمع أكبر يعرف باسم مفترق القمي 4. تدفق أيون عبر حاجز الأنسجة قد تذهب إما عن طريق العابر للخلايا (من خلال الخلية) أو عن طريق paracellular (بين اثنين من الخلايا المجاورة) مسار. مجموعالنقل سواء من خلال مسارات يعرف باسم المقاومة بطريق الظهارة. تقاطع القمي هو المسؤول عن تنظيم الأيونات وجزيئات تمر عبر حاجز 5،6 عبر فتحة محددة وظيفة الإغلاق. وغالبا ما ترتبط خلل أو تعطل هذه المجمعات البروتين لمرض 7-11. بالإضافة إلى ذلك، لا يعرف العديد من مسببات الأمراض المعوية / السموم خصيصا لاستهداف هذا المجمع، وبالتالي تدخل الجسم ويؤدي إلى الإسهال، وعلى الأرجح نتيجة التقلبات الهائلة من تدفق أيون / المياه عبر الحاجز 12-14. ويمكن أيضا أن يتم تعديل الحاجز الأنسجة عن طريق تغيير المكروية خارج الخلية. كادهيرين هو بروتين حاسم لالتصاق خلية خلية، وتشارك في تشكيل تقاطع القمي. مطلوب الكالسيوم عن التشكل الهيكلي الصحيح من كادهيرين، ولقد ثبت انخفاضا في خارج الخلية الكالسيوم أن يؤدي إلى تدمير تقاطع خلية خلية وافتتاح اللاحقة للمسار paracellular بين خلايا 15. في هذه الدراسة، EGTA (الإيثيلين جليكول مكرر (بيتا aminoethyl الأثير)-N، N، N '، وحامض الخليك N'رباعي)، وخالب الكالسيوم محددة، وكان يستخدم للحث على خرق الحاجز في الأنسجة، كما أن لديها وقد تبين أن يكون لها تأثير سريع وجذري على paracellular أيون تدفق 16،17. وقد استخدم هذا خالب الكالسيوم على متكدسة وأحادي الطبقة متباينة من خط الخلية كاتشو-2. مثقف في إدراج خلية ثقافة، ويعرف هذا الخط الخلية لتطوير خصائص الجهاز الهضمي، ويستخدم على نطاق واسع من جانب الصناعة الصيدلانية لاختبار امتصاص الأدوية 18،19.
أساليب لمراقبة سلامة الأنسجة الحاجز وفيرة. هذه الأساليب هي في كثير من الأحيان البصرية، والاعتماد على تلطيخ المناعي للبروتينات خاصة من المعروف أن عند تقاطع قمي 20، أو الاعتماد على القياس الكمي للجزيء التتبع الفلورسنت التي عادة غير منفذ للأنسجة حاجز21،22. ومع ذلك، وأساليب خالية من التسمية (أي بدون fluorophore / حامل اللون) هي الأفضل مثل استخدام تسمية يمكن أن تحمل الأعمال الفنية، وغالبا ما يزيد من تكلفة الفحص والوقت. وقد برزت، ورصد تسمية خالية من الأنسجة الكهربائية حاجز مؤخرا كوسيلة من وسائل الرصد الحيوي 23. على سبيل المثال سمحت التطورات التكنولوجية الحديثة في مقاومة الكهربائية الطيفي تطوير جهاز المسح الضوئي المتوفرة تجاريا 24،25 التي يمكن قياس المقاومة بطريق الظهارة (TER)، وهو قياس تصرف أيون عبر طبقة الخلايا.
وقد خلق الالكترونيات العضوية فرصة فريدة للتواصل في عالم الالكترونيات وعلم الأحياء 26،27 28،29 باستخدام إجراء البوليمرات التي يمكن إجراء كل من الناقلين الالكترونية والأيونية. تم استحداث تقنية جديدة للكشف عن المخالفات في الأنسجة حاجز باستخدام OECT 30-32 مؤخرا. والتحقق من صحة هذا الجهاز ضد التقنيات القائمة بناإد لتقييم سلامة حاجز الأنسجة، بما في ذلك المناعي، فحوصات النفاذية باستخدام وسيفر الصفراء، ومقاومة التحليل الطيفي باستخدام Cellzscope. في حالة جميع المركبات السامة اختبارها، تم العثور على OECT للعمل مع حساسية مساوية أو أفضل، مع زيادة والقرار الزماني، بالمقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه. في هذا الجهاز، PEDOT: جهاز الأمن الوقائي، وإجراء البوليمر التي قد تظهر لتكون مستقرة وحيويا 33،34، ويستخدم كمادة نشطة في القناة الترانزستور. يتكون OECT هجرة ومصدر أقطاب كهربائية على جانبي قناة البوليمر التوصيلي. ثم يتم وضع هذا في اتصال مع المنحل بالكهرباء، والتي تشكل جزءا لا يتجزأ من الجهاز. هي مغمورة A القطب البوابة في الكهارل (الشكل 1)، وعندما يتم تطبيق الجهد بوابة إيجابية عند البوابة، يضطر الكاتيونات من بالكهرباء في القناة، وبالتالي dedoping البوليمر وإجراء يؤدي إلى تغيير في مصدر استنزاف الحالية. دevice بالتالي حساسة للغاية لتغييرات في اللحظة في تدفق الأيونية بسبب التضخيم من الترانزستور. وضعت طبقة الخلايا نمت على إدراج ثقافة الخلية بين القطب البوابة والقناة الموصلة البوليمر. وجود طبقة الخلايا سليمة بمثابة حاجز للالكاتيونات الدخول في البوليمر إجراء، وبالتالي، في وجود أحادي الطبقة سليمة، والانخفاضات الحالية هجرة (الشكل 2: الانتقال من المنطقة لب). في وجود مركب سام، فإن الأنسجة حاجز تفقد تدريجيا سلامتها، والسماح للالكاتيونات دخول في فيلم البوليمر وزيادة استنزاف الحالية (الشكل 2: المنطقة ج). مع هذا الأسلوب، يعتبر خرق في الأنسجة حاجز من التشكيل الحالي للهجرة، الموافق للتعديل للتدفق عبر أحادي الطبقة. هذا الجهاز قادر على قياس التغيرات الدقيقة في تدفق الأيونية مع القرار الزماني غير مسبوقة وحساسية في الزمن الحقيقي. هذا فيل التكنولوجيال تكون ذات فائدة في مجال علم السموم لاختبار المخدرات، وتشخيص الأمراض أو البحوث الأساسية كنموذج حاجز يمكن تكييفها بسهولة. وهذا الأسلوب يساعد أيضا على الحد من التجارب على الحيوانات، كما أنه يتيح التحقق من صحة نماذج في المختبر ليحل محل اختبار في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا الأسلوب طريقة جديدة لدمج الترانزستور الكهروكيميائية العضوية مع الخلايا الحية لقياس سلامة الأنسجة الحاجز. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي سرعة وحساسية، ولكن أيضا انخفاض تكلفة الجهاز لرصد دينامية من الأنسجة الحاجز.
كم?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واضعو هذه الدراسة لم يكن لديك أي مصالح مالية المتنافسة.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
- Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
- Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
- Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
- Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
- Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
- Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
- Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
- Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
- Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex–news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
- Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
- Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
- Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
- Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
- Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
- Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
- Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
- Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
- Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
- Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
- Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. , (2010).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
- White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole – Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
- Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
- Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
- Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
- Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
- Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
