חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני
Summary
טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני משולב עם תאי חיים ומשמש לניטור שטף יונים על פני מחסום האפיתל במערכת העיכול. במחקר זה, עלייה בשטף יונים, הקשורים להפרעה בצומת הדוקים, הנגרמת על ידי הנוכחות של EGTA chelator סידן (גליקול-BIS אתילן (אתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', אצטית N'-טטרה חומצה), הוא נמדדה.
Abstract
מערכת העיכול היא דוגמא של רקמת מחסום המספקת מכשול פיזי מפני כניסה של פתוגנים ורעלים, תוך מתן אפשרות למעבר של יונים ומולקולות הדרושים. פרצה בגדר זה יכול להיגרם על ידי ירידה בריכוז הסידן תאי. ירידה בריכוז סידן זה גורמת לשינוי קונפורמציה בחלבונים המעורבים באיטום של הגדר, מה שמוביל לעלייה של שטף paracellular. כדי לחקות את האפקט הזה סידן chelator אתילן גליקול-BIS (האתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', חומצת N'-טטרה אצטית (EGTA) שימשה בmonolayer של תאים הידועים להיות נציג של מערכת העיכול. שיטות שונות כדי לזהות את ההפרעה של רקמת המכשול שכבר קיימות, כגון מבחני immunofluorescence וחדירות. עם זאת, שיטות אלו גוזלות זמן ויקר ואינו מתאימים למדידות דינמיות או תפוקה גבוהה. שיטות אלקטרוניות למדידת רקמות מחסוםשלמות קיימת גם למדידת התנגדות transepithelial (TER), אולם אלה הם בדרך כלל יקרים ומורכבים. פיתוח שיטות מהירים, זולות, ורגישות יש צורך דחוף בשלמות רקמת מכשול הוא פרמטר מרכזי בגילוי סמים ואבחון הפתוגן / רעלן. טרנזיסטור האורגני אלקטרוכימיים (OECT) משולב עם רקמת מחסום יוצרת תאים הוכח כמכשיר חדש מסוגל דינמי ניטור שלמות רקמות מכשול. המכשיר הוא מסוגל למדוד וריאציות דקות בשטף היוני עם רזולוציה של זמן חסר תקדים וברגישות, בזמן אמת, כמדד לשלמות רקמות מכשול. שיטה חדשה זה מבוססת על מכשיר פשוט שיכול להיות תואם עם יישומי הקרנת תפוקה גבוהה ומפוברקות בעלות נמוכה.
Introduction
אפיתל במערכת העיכול הוא דוגמא של רקמת מכשול, אשר שולטת במעבר של מולקולות בין תאים שונים בגוף. האפיתל מורכב מתאי עמודים מוארכים חברו יחד על ידי קומפלקסים של חלבונים המספקים מכשול פיזי 1 נגד פתוגנים ורעלים, תוך מתן אפשרות למעבר של מים וחומרים מזינים הדרושים כדי לקיים את הגוף. סלקטיביות זאת בשל הקיטוב של תאי אפיתל, אשר יוצר שני תחומים קרום שונים: בצד apical של התאים שנחשפו ללום והן בצד הבסיסי של התאים מעוגנים על הרקמות הבסיסיות 2,3. צמתים הדוקים (TJ) הם קומפלקסים של חלבונים המצויים בחלק הפסגה של תאי האפיתל ומהווים חלק ממכלול גדול יותר הידוע בשם צומת הפסגה 4. זרימת יונים על פני רקמת המחסום עשויה גם ללכת דרך transcellular (באמצעות הסלולרי) או באמצעות paracellular (בין שני תאים סמוכים) מסלול. הסכום שלהתחבורה באמצעות שני המסלולים שמכונה התנגדות transepithelial. צומת הפסגה אחראית על הרגולציה של יונים ומולקולות עוברות על פני המחסום 5,6 דרך פתח ספציפי ותפקוד סוגר. חוסר תפקוד או שיבוש של קומפלקסי חלבונים אלה קשורים לעתים קרובות למחלה 7-11. בנוסף, רבים פתוגנים / רעלים enteric ידועים למקד מורכב זה באופן ספציפי, ובכך להיכנס לגוף ומוביל לשלשולים, סביר להניח כתוצאה של חוסר ויסות מסיבית של זרימת יונים / מים על פני המחסום 12-14. רקמת גדר יכולה גם להיות שונה על ידי שינוי microenvironment תאי. Cadherin הוא חלבון חיוני להידבקות תאי תאים, והוא מעורב ביצירת צומת הפסגה. סידן נדרש לקונפורמציה המבנית הנכונה של cadherin, וירידה בסידן תאי הוכח לגרום להרס של צומת תאי תאים ופתיחה הבאה שלמסלול paracellular בין התאים 15. במחקר זה, EGTA (גליקול-BIS אתילן (בטא aminoethyl אתר)-N, N, N ', חומצה אצטית N'-טטרה), chelator סידן ספציפי, היה בשימוש כדי לגרום להפרה ברקמת מכשול, שכן יש הוכח יש השפעה מהירה ודרסטית על paracellular יון לזרום 16,17. chelator סידן זה היה בשימוש על מחוברות וmonolayer המובחן של תא אונליין קאקו-2. בתרבית מוסיף תרבית תאים, קו תא זה ידוע לפתח את המאפיינים של מערכת העיכול ונמצא בשימוש נרחב על ידי תעשיית התרופות כדי לבדוק את הספיגה של תרופות 18,19.
שיטות לניטור שלמות רקמות מחסום נמצאות בשפע. שיטות אלה הן בדרך כלל אופטיות, בהסתמך על מכתים immunofluorescence של חלבונים מסוימים הידועים להיות בצומת הפסגה 20, או להסתמך על הכימות של מולקולה נותב ניאון שהיא בדרך כלל בלתי חדיר לרקמות המחסום21,22. עם זאת, שיטות ללא תווית (כלומר ללא fluorophore / כרומופור) עדיפות כמו השימוש בתווית יכולה להיגרם חפצים, ולעתים קרובות מגדיל את העלות וassay הזמן. ניטור של רקמת מחסום חשמלי, ללא תווית התפתחה לאחרונה כשיטת מעקב דינמית 23. לדוגמא התקדמות טכנולוגית האחרונה בספקטרוסקופיה עכבה החשמלית אפשרה הפיתוח של מכשירים לסריקה זמינים מסחרי 24,25 שיכול למדוד את התנגדות transepithelial (TER), מדידה של מוליכות יונים על פני שכבת התאים.
אלקטרוניקה אורגנית יצרה הזדמנות ייחודית להתממשק העולם של מוצרי אלקטרוניקה וביולוגיה 26,27 28,29 באמצעות פולימרים מוליכים שיכול לנהל שתי נושאות אלקטרוניות ויוניות. שיטה חדשה לאיתור פרצות ברקמת מחסום באמצעות 30-32 OECT הוצגה לאחרונה. מכשיר זה היה תוקף כנגד טכניקות הקיימותed להעריך שלמות מחסום רקמות, כולל immunofluorescence, מבחני חדירות באמצעות לוציפר צהוב, וספקטרוסקופיה עכבה באמצעות Cellzscope. במקרה של כל התרכובות הרעילות שנבדקו, OECT נמצא לפעול ברגישות שווה או טובה יותר, ועם רזולוציה של זמן מוגבר, בהשוואה לטכניקות שצוינה לעיל. במכשיר זה, PEDOT: PSS, פולימר ניצוח כי הוכח להיות יציב וביולוגי 33,34, משמש כחומר הפעיל בערוץ טרנזיסטור. OECT מורכב מאלקטרודות ניקוז והמקור משני צדי ערוץ פולימרים מוליכים. זה ממוקם אז במגע עם אלקטרוליט, המהווה חלק בלתי נפרד מהמכשיר. אלקטרודת שער היא שקועה בתוך אלקטרוליט (איור 1), וכאשר מתח שער חיובי מיושם בשער, קטיונים מאלקטרוליט נאלצים לתוך הערוץ, ובכך dedoping פולימר הניצוח וכתוצאה משינוי במקור הניקוז נוכחית. דevice לכן מאוד רגיש לשינויים של הרגע בשטף היוני בשל הגברה של טרנזיסטור. שכבת תאים גדלה על הוספת תרבית תאים הושמה בין האלקטרודה השער וערוץ הפולימרים המוליכים. הנוכחות של שכבת תאים שלמה משמשת כמחסום לקטיונים להיכנס לתוך פולימר הניצוח, ולכן, בנוכחות monolayer שלם, הירידות הנוכחיות הניקוז (איור 2: מעבר מהאזור לב). בנוכחות של תרכובת רעילה, רקמת מכשול בהדרגה לאבד את היושרה שלה, ומאפשרות קטיונים להיכנס לסרט הפולימרים והגדלת הנוכחי הניקוז (איור 2: אזור ג). בעזרת טכניקה זו, הפרה ברקמת מחסום נתפס על ידי האפנון של זרם הניקוז, המקביל למודולציה של השטף על פני השכבה. מכשיר זה מסוגל למדוד וריאציות דקות בשטף היוני עם רזולוציה חסרת תקדים של זמן ורגישות בזמן אמת. wil טכנולוגיה זוl להיות עניין בתחום של רעלים לבדיקות סמים, אבחון מחלה או מחקר בסיסי כמודל המחסום ניתן להתאים בקלות. שיטה זו גם תסייע להפחית את הניסויים בבעלי החיים, שכן היא מאפשרת האימות של במבחנה מודלים להחליף בבדיקות vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקה זו מספקת שיטה חדשה לשילוב טרנזיסטור אלקטרוכימיים אורגני עם תאי חיים כדי למדוד שלמות רקמות מכשול. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם המהירות ורגישות, אלא גם את העלות הנמוכה של המכשיר לניטור דינמי של רקמת מכשול.
כמו בשיטה זו מש?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים של מאמר זה אין לי שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
- Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
- Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
- Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
- Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
- Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
- Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
- Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
- Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
- Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex–news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
- Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
- Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
- Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
- Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
- Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
- Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
- Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
- Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
- Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
- Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
- Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. , (2010).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
- White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole – Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
- Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
- Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
- Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
- Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
- Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
