Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico
Summary
Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata.
Abstract
Il tratto gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera che fornisce una barriera fisica contro l'ingresso di agenti patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di ioni e molecole necessarie. Una violazione in questa barriera può essere causato da una riduzione della concentrazione di calcio extracellulare. Questa riduzione nella concentrazione di calcio provoca un cambiamento conformazionale di proteine coinvolte nella tenuta della barriera, portando ad un aumento del flusso paracellular. Per simulare questo effetto chelante calcio etilene glicole bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-acido acetico tetra (EGTA) è stato utilizzato su un monostrato di cellule note per essere rappresentativo del tratto gastrointestinale. Esistono già diversi metodi per rilevare la rottura del tessuto barriera, come immunofluorescenza e permeabilità saggi. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e costosa e non adatta per misure dinamiche o ad alto rendimento. Strumenti elettronici per la misurazione del tessuto barrieraintegrità esiste anche per la misura della resistenza transepiteliale (TER), tuttavia questi sono spesso costosi e complessi. Lo sviluppo di metodi rapidi, economici, e sensibili è urgente l'integrità del tessuto barriera è un parametro chiave nella scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica patogeno / tossina. Il transistor elettrochimica organica (OECT) integrato con il tessuto barriera formando cellule è stato dimostrato come un nuovo dispositivo in grado di controllare dinamicamente l'integrità del tessuto barriera. Il dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, in tempo reale, come indicatore di integrità del tessuto barriera. Questo nuovo metodo è basato su un semplice dispositivo che può essere compatibile con le applicazioni di screening ad alta produttività e fabbricato a basso costo.
Introduction
L'epitelio gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera, che controlla il passaggio di molecole tra differenti compartimenti del corpo. L'epitelio è costituito da cellule cilindriche allungate unite da complessi di proteine che forniscono una barriera fisica 1 contro patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di acqua e sostanze nutritive necessarie per sostenere il corpo. Questa selettività è dovuta alla polarizzazione delle cellule epiteliali, che crea due differenti domini di membrana: il lato apicale delle cellule esposte al lume e il lato basale delle cellule ancorate sui tessuti sottostanti 2,3. Giunzioni strette (TJ) sono complessi di proteine presenti nella porzione apicale delle cellule epiteliali e sono parte di un complesso più larga nota come la giunzione apicale 4. Flusso di ioni attraverso il tessuto barriera può andare sia tramite il transcellulare (attraverso la cella) o tramite un paracellular (tra due celle adiacenti) percorso. La somma diil trasporto attraverso entrambe le vie è noto come la resistenza transepiteliale. La giunzione apicale è responsabile della regolazione di ioni e molecole che passano attraverso la barriera 5,6 tramite una specifica funzione di chiusura e di apertura. Una disfunzione o alterazione di tali complessi proteici sono spesso correlati alla malattia 7-11. Inoltre, molti enterici patogeni / tossine sono noti per indirizzare specificamente questo complesso, entrando così il corpo e che porta a diarrea, molto probabilmente come conseguenza della massiccia disregolazione del flusso di ioni / acqua attraverso la barriera 12-14. Tessuto barriera può anche essere modificato cambiando il microambiente extracellulare. Caderina è una proteina critica per adesione cellula-cellula, ed è coinvolta nella formazione della giunzione apicale. Il calcio è necessaria per la conformazione strutturale corretta di caderina, e una diminuzione del calcio extracellulare ha dimostrato di causare la distruzione della giunzione cellula-cellula e una successiva apertura delparacellular percorso tra le celle 15. In questo studio, EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-acido acetico tetra), uno specifico chelante del calcio, è stato usato per indurre una breccia nel tessuto barriera, in quanto ha dimostrato di avere un effetto rapido e drastico sul paracellulare ion flusso 16,17. Questo chelante del calcio è stato utilizzato su un monostrato confluente e differenziata della linea cellulare Caco-2. Coltivate in inserti coltura cellulare, questa linea cellulare è noto per sviluppare le caratteristiche del tratto gastrointestinale ed è ampiamente utilizzato dall'industria farmaceutica per testare l'assorbimento di farmaci 18,19.
Metodi per monitorare l'integrità dei tessuti barriera sono abbondanti. Questi metodi sono spesso ottica, basandosi su immunofluorescenza di particolari proteine note per essere all'incrocio apicale 20, o basandosi sulla quantificazione di una molecola tracciante fluorescente che è normalmente impermeabile al tessuto barriera21,22. Tuttavia, i metodi label-free (ovvero senza un fluoroforo / cromoforo) sono preferibili come l'uso di un'etichetta può incorrere artefatti, e spesso aumenta il tempo di costo e dosaggio. Elettrico, monitoraggio senza etichetta di tessuto barriera è recentemente emerso come un metodo di monitoraggio dinamico 23. Ad esempio recenti progressi tecnologici nella spettroscopia di impedenza elettrica hanno consentito lo sviluppo di un apparecchio di scansione disponibile in commercio 24,25 che può misurare la resistenza transepiteliale (TER), una misurazione della conduttanza di ioni attraverso lo strato di cellule.
Elettronica organica ha creato un'opportunità unica per interfacciare il mondo dell'elettronica e della biologia 26,27 28,29 utilizzando polimeri conduttori che possono condurre entrambi i vettori elettronici e ionici. Una nuova tecnica per rilevare le infrazioni in tessuto barriera usando l'OECT 30-32 è stato recentemente introdotto. Questo dispositivo è stato validato con tecniche esistenti con noiEd valutare integrità della barriera di tessuto, tra cui immunofluorescenza, test di permeabilità con Lucifero giallo, e spettroscopia di impedenza utilizzando il Cellzscope. Nel caso di tutti i composti tossici testati, il OECT stato trovato per operare con sensibilità uguale o migliore, e con maggiore risoluzione temporale, rispetto alle tecniche precedenti. In questo dispositivo, PEDOT PSS, un polimero conduttore che ha dimostrato di essere stabile e biocompatibile 33,34, viene utilizzato come materiale attivo nel canale transistor. Il OECT è composto di elettrodi di drain e di source su entrambi i lati di un canale polimero conduttivo. Questo viene poi messo in contatto con un elettrolita, che costituisce parte integrante del dispositivo. Un elettrodo di gate è immerso nell'elettrolita (Figura 1), e quando una tensione di gate positiva è applicata al gate, cationi dell'elettrolita sia costretto ad entrare canale, dedoping così il polimero conduttore ed una conseguente variazione del source-drain corrente. Il device è quindi estremamente sensibile ai cambiamenti minute a flusso di ioni a causa di amplificazione del transistor. Uno strato di cellule coltivate su un inserto di coltura cellulare è stata posta tra l'elettrodo di gate e il canale polimero conduttivo. La presenza di uno strato di cellule intatte agisce come barriera per i cationi entrare nel polimero conduttore, quindi, in presenza di un monostrato intatto, la corrente diminuisce di scarico (Figura 2: transizione da una regione a b). In presenza di un composto tossico, il tessuto barriera progressivamente perdere la sua integrità, lasciando che i cationi entrano nel film polimerico e aumentando la corrente di drain (Figura 2: regione c). Con questa tecnica, la breccia nel tessuto barriera è visto dalla modulazione della corrente di drain, corrispondente alla modulazione del flusso attraverso il monostrato. Questo dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e la sensibilità in tempo reale. Questo wil tecnologial essere di interesse nel campo della tossicologia per il test anti-droga, diagnostica delle malattie o di ricerca di base, come il modello di barriera può essere facilmente adattato. Questo metodo aiuterà anche a ridurre la sperimentazione animale, in quanto consente la validazione dei modelli in vitro per sostituire nei test in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa tecnica fornisce un nuovo metodo per integrare un transistore elettrochimica organica con cellule vive per misurare l'integrità del tessuto barriera. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità e sensibilità, ma anche il basso costo del dispositivo per il controllo dinamico di tessuto barriera.
Poiché questo metodo utilizza cellule vive, un punto critico è quello di assicurarsi di utilizzare un monostrato, che rappresenta uno strato barriera intatto. I parametri …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori di questo documento non hanno interessi finanziari concorrenti.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
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