Зондирование Барьерного ткани Срыв с транзистора Органическая Электрохимический
Summary
Органический Электрохимический транзистор интегрирован с живыми клетками и используется для контроля поток ионов через желудочно-кишечный эпителиальный барьер. В этом исследовании, увеличение потока ионов, связанных с нарушением плотных контактов, индуцированной присутствии хелатора кальций EGTA (этиленгликоль-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислота), измеряется.
Abstract
Желудочно-кишечного тракта является примером барьерной ткани, что обеспечивает физический барьер от проникновения патогенов и токсинов, позволяя при этом прохождение необходимых ионов и молекул. Нарушение этого барьера может быть вызвана снижением внеклеточной концентрации кальция. Это уменьшение концентрации кальция вызывает конформационное изменение белков, участвующих в герметизации барьера, что приводит к увеличению потока парацеллюлярной. Для имитации этого эффекта кальциевые хелатор этиленгликоля-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислоты (EGTA) использовали на монослой клеток, известных как представитель из желудочно-кишечного тракта. Различные методы для обнаружения нарушения барьерной ткани уже существуют, например, иммунофлюоресценции и проницаемости анализов. Однако эти методы требуют больших затрат времени и дорого и не подходит для динамических или высокой пропускной измерений. Электронные методы измерения барьерную тканьЦелостность также существуют для измерения сопротивления трансэпителиальной (TER), однако они часто дорогостоящим и сложным. Развитие быстрых, дешевых и чувствительных методов срочно необходима как целостность барьера ткани является ключевым параметром в лекарственных препаратах и диагностике возбудителя / токсина. Органический электрохимический транзистор (OECT) интегрирован с барьером ткань формирования клеток было показано как новое устройство, способный динамически контроль целостности барьерной ткани. Устройство может измерять мельчайшие изменения в ионной потока с беспрецедентной временным разрешением и чувствительностью, в реальном времени, в качестве индикатора целостности барьерного ткани. Этот новый способ основан на простое устройство, которое может быть совместим с скрининга приложений с высокой пропускной способностью и изготовлен по низкой цене.
Introduction
Желудочно-кишечный эпителий является примером барьерной ткани, который контролирует прохождение молекул между различными отсеков тела. Эпителий состоит из удлиненных столбчатых клеток соединены друг с другом комплексов белков, которые обеспечивают физический барьер 1 против патогенов и токсинов, позволяя при этом прохождение воды и питательных веществ, необходимых для поддержания тела. Такая избирательность обусловлена поляризации эпителиальных клеток, что создает два различных мембранных доменов: апикальной стороне клеток, подвергнутых воздействию просвета и базальной стороне клеток на якорь на подлежащие ткани 2,3. Плотные соединения (TJ) представляют собой комплексы белков, присутствующих на апикальной части эпителиальных клеток и являются частью более крупного комплекса, известного как апикальной стыке 4. Ион поток через барьер ткани может либо пойти через трансцеллюлярного (через ячейку) или через парацеллюлярная (между двумя соседними клетками) тропа. Сумматранспорт через обоих путей известен как сопротивление трансэпителиальной. Апикальный узел отвечает за регулирование ионов и молекул, проходящих через барьер 5,6 с помощью специальной открытия и закрытия функции. Дисфункция или нарушение этих белковых комплексов часто связано с болезнью 7-11. Кроме того, многие кишечные возбудителей / токсины, как известно, в частности, цель данного комплекса, таким образом, поступающих в организм и приводит к диарее, скорее всего, как следствие массивной регуляции потока ион / воды через барьер 12-14. Барьер ткани могут быть также модифицированы путем изменения внеклеточного микросреду. Cadherin является критическим для белок межклеточной адгезии, а также участвует в формировании апикальной перехода. Кальций необходим для правильного структурной конформации кадгерина, и уменьшение внеклеточный кальций, как было показано привести к разрушению клетка-клетка перехода и последующего открытияпарацеллюлярная путь между клетками 15. В этом исследовании, EGTA (этиленгликоль-бис (бета-аминоэтил эфир)-N, N, N ', N'-тетра уксусной кислоты), специфический хелатирующий агент кальция, был использован, чтобы вызвать нарушение в барьерной ткани, как это имеет Было показано, что быстрое и сильное воздействие на парацеллюлярной потока ионов 16,17. Этот хелатор кальций был использован на сливной и дифференцированной монослое клеточной линии Сасо-2. Искусственный в культуре клеток вставки, эта клеточная линия, как известно, развивать характеристики желудочно-кишечного тракта и широко используется в фармацевтической промышленности для проверки всасывание лекарственных 18,19.
Методы для мониторинга целостности барьера тканей многочисленны. Эти методы часто оптические, опираясь на иммунофлюоресцентного окрашивания конкретных белков, известных как в апикальной стыке 20, или опираясь на количественного флуоресцентного индикаторного молекулы, который обычно непроницаемы для барьерной ткани21,22. Тем не менее, без наклеек методы (то есть без флуорофора / хромофора) являются предпочтительными в качестве использование этикетке может понести артефакты, и часто увеличивает стоимость и анализа времени. Электрические, этикетка без мониторинг барьера ткани недавно стала динамического метода мониторинга 23. Например последних технологических достижений в электрической импедансной спектроскопии позволили развитие коммерчески доступного аппарата сканирования 24,25, который может измерять трансэпителиальный сопротивление (TER), измерения ионного проводимости через клеточную слоя.
Органическая электроника создал уникальную возможность для взаимодействия в мире электроники и биологии 26,27 28,29 помощью проводящих полимеров, которые могут проводить как электронные, так и ионные носители. Новая техника для выявления нарушений в барьерном ткани с помощью OECT 30-32 недавно был введен. Это устройство было сверяются существующих методик насред оценить целостности барьера тканей, в том числе иммунофлюоресценции, анализов проницаемости с использованием Люцифер желтый и импедансной спектроскопии с помощью Cellzscope. В случае всех токсичных соединений была OECT было обнаружено работать с равной или лучшей чувствительности и с повышенным временным разрешением по сравнению с вышеуказанными методами. В этом устройстве PEDOT: PSS, проводящий полимер, который, как было показано, чтобы быть стабильной и биосовместимый 33,34, используется в качестве активного материала в канале транзистора. OECT состоит из сливных и исходных электродов по обе стороны от полимерного электропроводного канала. Это затем вводят в контакт с электролитом, который образует неотъемлемую часть устройства. Ворота электрод погружают в электролит (рис. 1), а в случае положительного напряжения на затворе применяется в воротах, катионы из электролита вынуждены в канале, тем самым dedoping проводящий полимер и приводит к изменению в исток-сток тока. Гevice Таким образом, чрезвычайно чувствительны к малейшие изменения в ионной потока из-за усиления по транзистора. Слой клеток, выращенных на культуре клеток вставки был помещен между электродом затвора и проводящего полимера канала. Наличие неповрежденной слоя клеток выступает в качестве барьера для катионы, входящие в проводящего полимера, таким образом, в присутствии неповрежденной монослоя, ток уменьшается дренажные (рис. 2: переход от области А: В). В присутствии токсичных соединения, барьер ткань будет постепенно терять свою целостность, позволяя катионы войти в полимерной пленки и повышение ток стока (Рисунок 2: область с). С помощью данной методики, нарушение в барьерной ткани рассматривается модуляции тока стока, соответствующая модуляции потока через монослой. Это устройство может измерять мельчайшие изменения в ионной потока с беспрецедентной временным разрешением и чувствительностью в режиме реального времени. Данная технология Вильл представлять интерес в области токсикологии для тестирования на наркотики, диагностики заболеваний или фундаментальных исследований, как модель барьер может быть легко адаптированы. Этот метод также поможет уменьшить экспериментов на животных, так как позволяет валидация моделей в пробирке, чтобы заменить в естественных условиях тестирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта техника обеспечивает новый способ интеграции органический электрохимический транзистор с живых клеток для измерения целостности барьера ткани. Основные преимущества этого метода являются быстрота и чувствительность, но и низкая стоимость устройства для динамического монитори?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы этой бумаги не имеют никаких конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
References
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco-2 cell line. Infect. Immun. 64, 1299-1308 (1996).
- Anderson, J. M., Balda, M. S., Fanning, A. S. The structure and regulation of tight junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 772-778 (1993).
- Guttman, J. A., Finlay, B. B. Tight junctions as targets of infectious agents. Biochim. Biophys. Acta. 1788, 832-841 (2009).
- Anderson, J. M. Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial transport. News. Physiol. Sci. 16, 126-130 (2001).
- Anderson, J. M., Van Itallie, C. M. Tight junctions: Closing in on the seal. Curr. Biol. 9, (1999).
- Ma, T. Y., Boivin, M. A., Ye, D., Pedram, A., Said, H. M. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288, 422-430 (2005).
- Schulzke, J. D., et al. Epithelial tight junctions in intestinal inflammation. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1165, 294-300 (2009).
- Fisher, S. J., Swaan, P. W., Eddington, N. D. The ethanol metabolite acetaldehyde increases paracellular drug permeability in vitro and oral bioavailability in vivo. The J. Pharmacol. Exp. Therap. 332, 326-333 (2010).
- Ma, T. Y., Nguyen, D., Bui, V., Nguyen, H., Hoa, N. Ethanol modulation of intestinal epithelial tight junction barrier. Am. J. Physiol. 276, 965-974 (1999).
- Nemeth, E., Halasz, A., Barath, A., Domokos, M., Galfi, P. Effect of hydrogen peroxide on interleukin-8 synthesis and death of Caco-2 cells. Immunopharmacol. Immunotoxicol. 29, 297-310 (2007).
- Vogelmann, R., Amieva, M. R., Falkow, S., Nelson, W. J. Breaking into the epithelial apical-junctional complex–news from pathogen hackers. Curr. Opin. Cell Biol. 16, 86-93 (2004).
- Nusrat, A., et al. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect. Immun. 69, 1329-1336 (2001).
- Obert, G., Peiffer, I., Servin, A. L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers. J. Virol. 74, 4645-4651 (2000).
- Nagar, B., Overduin, M., Ikura, M., Rini, J. M. Structural basis of calcium-induced E-cadherin rigidification and dimerization. Nature. 380, 360-364 (1996).
- Boulenc, X., et al. Importance of the paracellular pathway for the transport of a new bisphosphonate using the human Caco-2 monolayers model. Biochem. Pharmacol. 46, 1591-1600 (1993).
- Artursson, P., Magnusson, C. Epithelial transport of drugs in cell culture. II: Effect of extracellular calcium concentration on the paracellular transport of drugs of different lipophilicities across monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 595-600 (1990).
- Artursson, P. Epithelial transport of drugs in cell culture. I: A model for studying the passive diffusion of drugs over intestinal absorptive (Caco-2) cells. J. Pharm. Sci. 79, 476-482 (1990).
- Artursson, P., Karlsson, J. Correlation between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco-2) cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 880-885 (1991).
- Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. J. Cell Biol. 134, 1031-1049 (1996).
- Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G. E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).
- Uchida, M., Fukazawa, T., Yamazaki, Y., Hashimoto, H., Miyamoto, Y. A modified fast (4 day) 96-well plate Caco-2 permeability assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 59, 39-43 (2008).
- Krug, S. M., Fromm, M., Gunzel, D. Two-Path Impedance Spectroscopy for Measuring Paracellular and Transcellular Epithelial Resistance. Biophys. J. 97, 2202-2211 (2009).
- Wegener, J., Abrams, D., Willenbrink, W., Galla, H. J., Janshoff, A. Automated multi-well device to measure transepithelial electrical resistances under physiological conditions. BioTechniques. 37, 592-594 (2004).
- Weber, C. R., Shen, L., Wu, L., Wang, Y., Turner, J. R. Occludin is Required for Tumor Necrosis Factor (TNF)-Mediated Regulation of Tight Junction (TJ) Barrier Function. Gastroenterology. 140, (2011).
- Owens, R. M., Malliaras, G. G. Organic electronics at the interface with biology. MRS Bull. , (2010).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J. J., Chan, H. L. W., Yang, M. The Application of Organic Electrochemical Transistors in Cell-Based Biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
- White, H. S., Kittlesen, G. P., Wrighton, M. S. Chemical Derivatization of an Array of 3 Gold Microelectrodes with Polypyrrole – Fabrication of a Molecule-Based Transistor. J. Am. Chem. Soc. 106, 5375-5377 (1984).
- Bernards, D. A., Malliaras, G. G. Steady-state and transient behavior of organic electrochemical transistors. Adv. Funct. Mater. 17, 3538-3544 (2007).
- Jimison, L. H., et al. Measurement of Barrier Tissue Integrity with an Organic Electrochemical Transistor. Adv. Mater. 24, 5919-5923 (2012).
- Tria, S., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Sensing of EGTA Mediated Barrier Tissue Disruption with an Organic Transistor. Biosensors. 3, 44-57 (2013).
- Tria, S. A., Jimison, L. H., Hama, A., Bongo, M., Owens, R. M. Validation of the organic electrochemical transistor for in vitro toxicology. Biochim. Biophys. Acta. 1830, 4381-4390 (2013).
- Zhu, Z. T., et al. A simple poly(3,4-ethylene dioxythiophene)/poly(styrene sulfonic acid) transistor for glucose sensing at neutral pH. Chem. Commun. , 1556-1557 (2004).
- Lin, P., Yan, F., Yu, J., Chan, H. L., Yang, M. The application of organic electrochemical transistors in cell-based biosensors. Adv. Mater. 22, 3655-3660 (2010).
