Detección de barrera interrupción del tejido con un transistor orgánico Electroquímica
Summary
El transistor orgánico electroquímico está integrado con células vivas y se utiliza para controlar el flujo de iones a través de la barrera epitelial intestinal. En este estudio, un incremento en el flujo de iones, relacionados con la alteración de las uniones estrechas, inducida por la presencia de la EGTA quelante de calcio (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-tetra acético ácido), se mide.
Abstract
El tracto gastrointestinal es un ejemplo de tejido de barrera que proporciona una barrera física contra la entrada de patógenos y toxinas, mientras que permite el paso de iones y moléculas necesarias. Una violación de esta barrera puede ser causada por una reducción en la concentración de calcio extracelular. Esta reducción en la concentración de calcio causa un cambio conformacional en las proteínas implicadas en el sellado de la barrera, lo que lleva a un aumento del flujo paracelular. Para imitar este efecto los quelantes de calcio ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', se utilizó ácido acético N'-tetra (EGTA) en una monocapa de células conocidas para ser representativa del tracto gastrointestinal. Ya existen diferentes métodos para detectar la interrupción de la barrera de tejido, tales como ensayos de inmunofluorescencia y de permeabilidad. Sin embargo, estos métodos son mucho tiempo y costoso y no es adecuado para mediciones dinámicas o de alto rendimiento. Métodos electrónicos para la medición de tejido de barreraintegridad también existe para la medición de la resistencia transepitelial (TER), sin embargo, estos son a menudo costoso y complejo. El desarrollo de métodos rápidos, baratos y sensibles se necesita con urgencia como la integridad de los tejidos de barrera es un parámetro clave en el descubrimiento de fármacos y el diagnóstico de patógenos / toxina. El transistor de electroquímica orgánica (OECT) integrada con el tejido barrera de la formación de células se ha mostrado como un nuevo dispositivo capaz de monitorizar dinámicamente la integridad del tejido barrera. El dispositivo es capaz de medir las variaciones minutos en flujo iónico con resolución temporal sin precedentes y sensibilidad, en tiempo real, como un indicador de la integridad del tejido de barrera. Este nuevo método se basa en un dispositivo simple que puede ser compatible con las aplicaciones de cribado de alto rendimiento y fabricado a bajo costo.
Introduction
El epitelio gastrointestinal es un ejemplo de tejido de barrera, que controla el paso de moléculas entre los diferentes compartimentos del cuerpo. El epitelio se compone de células columnares alargados unidos entre sí por complejos de proteínas que proporcionan una barrera física 1 contra patógenos y toxinas, mientras que permite el paso del agua y los nutrientes necesarios para sostener el cuerpo. Esta selectividad es debido a la polarización de las células epiteliales, lo que crea dos dominios de membrana diferentes: la parte apical de las células expuestas a la luz y la parte basal de las células ancladas en los tejidos subyacentes 2,3. Las uniones estrechas (TJ) son complejos de proteínas presentes en la parte apical de las células epiteliales y son parte de un complejo más amplio conocido como la unión apical 4. Flujo de iones a través del tejido de barrera puede ir ya sea a través de la transcelular (a través de la célula) o a través de un paracelular (entre dos células adyacentes) vía. La suma de losel transporte a través de ambas vías se conoce como la resistencia transepitelial. La unión apical es responsable de la regulación de los iones y moléculas que pasan a través de la barrera de 5,6 a través de una abertura específica y función de cierre. Una disfunción o alteración de estos complejos de proteínas es a menudo relacionado con la enfermedad 7-11. Además, muchos agentes patógenos / toxinas entéricos son conocidos para dirigirse específicamente a este complejo, entrando así al cuerpo y que conduce a la diarrea, muy probablemente como consecuencia de la desregulación masiva de flujo de iones / agua a través de la barrera 12-14. Tejido barrera también puede ser modificado cambiando el microambiente extracelular. Cadherina es una proteína crítica para la adhesión célula-célula, y está implicado en la formación de la unión apical. El calcio es necesario para la conformación estructural correctos de cadherina, y una disminución en el calcio extracelular se ha demostrado que resulta en la destrucción de la unión célula-célula y una abertura posterior de lavía paracelular entre las células 15. En este estudio, EGTA (ácido etilenglicol-bis (beta-aminoetil éter)-N, N, N ', N'-ácido acético TETRA), un quelante de calcio específico, fue utilizado para inducir una brecha en el tejido de barrera, ya que tiene ha demostrado que tienen un efecto rápido y drástico en paracelular flujo de iones a 16,17. Este quelante de calcio se utiliza en una monocapa confluente y diferenciada de la de la línea celular Caco-2. Cultivaron en insertos de cultivo de células, esta línea celular se sabe que se desarrollan las características del tracto gastrointestinal y se utiliza ampliamente por la industria farmacéutica para probar la absorción de fármacos 18,19.
Métodos para monitorear la integridad del tejido barrera son abundantes. Estos métodos son a menudo óptico, basándose en la tinción de inmunofluorescencia de proteínas particulares que se sabe que en la unión apical 20, o basándose en la cuantificación de una molécula de trazador fluorescente que es normalmente impermeable al tejido barrera21,22. Sin embargo, los métodos de etiquetado libre (es decir, sin un fluoróforo / cromóforo) son preferibles como el uso de una etiqueta puede incurrir en artefactos, ya menudo aumenta el costo y tiempo de ensayo. Supervisión eléctrica, libre de marca de tejido barrera ha surgido recientemente como un método dinámico de supervisión 23. Por ejemplo recientes avances tecnológicos en la espectroscopia de impedancia eléctrica han permitido el desarrollo de un aparato de exploración disponibles comercialmente 24,25 que pueden medir la resistencia transepitelial (TER), una medición de la conductancia de iones a través de la capa de células.
La electrónica orgánica ha creado una oportunidad única para interconectar el mundo de la electrónica y la biología 26,27 28,29 mediante el uso de polímeros conductores que pueden conducir tanto a portadores electrónicos e iónicos. Una nueva técnica para detectar infracciones en el tejido barrera utilizando la OECT 30-32 se introdujo recientemente. Este dispositivo se ha validado con las técnicas existentes nosed para evaluar integridad de la barrera de tejido, incluyendo inmunofluorescencia, ensayos de permeabilidad utilizando Lucifer amarillo y espectroscopia de impedancia usando el Cellzscope. En el caso de todos los compuestos tóxicos ensayados, la OECT se encontró para operar con una sensibilidad igual o mejor, y con el aumento de la resolución temporal, en comparación con las técnicas anteriores. En este dispositivo, de PEDOT: PSS, un polímero conductor que se ha demostrado ser estable y biocompatible 33,34, se utiliza como el material activo en el canal del transistor. La OECT está compuesta de drenaje y fuente electrodos a cada lado de un canal de polímero conductor. Este se coloca entonces en contacto con un electrolito, que forma una parte integral del dispositivo. Un electrodo de puerta se sumerge en el electrolito (Figura 1), y cuando se aplica una tensión de puerta positivo en la puerta, de cationes del electrolito son forzados dentro del canal, desdopado así el polímero conductor y que resulta en un cambio en la fuente-drenaje actual. El device es por lo tanto extremadamente sensibles a los cambios minutos en flujo iónico debido a la amplificación por el transistor. Una capa de células cultivadas en un inserto de cultivo celular se colocó entre el electrodo de puerta y del canal de polímero conductor. La presencia de una capa de células intactas actúa como barrera para los cationes de entrar en el polímero conductor, por lo tanto, en presencia de una monocapa intacta, la corriente disminuye de drenaje (Figura 2: transición de la región de A a B). En la presencia de un compuesto tóxico, el tejido de barrera perderá progresivamente su integridad, dejando que los cationes entran en la película de polímero y aumentando la corriente de drenaje (Figura 2: región C). Con esta técnica, la brecha en el tejido de barrera es visto por la modulación de la corriente de drenaje, que corresponde a la modulación del flujo a través de la monocapa. Este dispositivo es capaz de medir pequeñas variaciones en el flujo iónico con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad en tiempo real. Este Wil tecnologíal ser de interés en el campo de la toxicología de las pruebas de drogas, el diagnóstico de enfermedades o la investigación básica como el modelo de barrera puede ser adaptado fácilmente. Este método también ayudará a reducir la experimentación con animales, ya que permite la validación de los modelos in vitro para sustituir a los ensayos in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica proporciona un nuevo método para integrar un transistor electroquímica orgánica con células vivas para medir la integridad del tejido de barrera. Las principales ventajas de esta técnica son la rapidez y sensibilidad, sino también el bajo coste del dispositivo para el control dinámico de tejido de barrera.
Como este método utiliza células vivas, un punto crítico es que asegúrese de usar una monocapa, lo que representa una capa de barrera intacta. Los parámetros de l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores de este trabajo no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| CLEVIOS PH 1000 | HERAUS CLEVIOS | ||
| AZ9260 resin | CIPEC SPECIALITIES | ||
| Dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Culture insert Millicell PET 0.4 μm Millipore | Dominique dutscher | 51705 | |
| 24-well cell culture plate BD Falcon | Dominique dutscher | 51705 | |
| STERICUP-GP PES 0.22 μM | Dominique dutscher | 51246 | |
| ADVANCED DMEM Marque GIBCO | Fisher scientific | E3434T | |
| FBS HEAT INACT. S.AMERICAN | Fisher scientific | E3387M | |
| PENICILLIN STREPTOMYCIN | Fisher scientific | E3470C | |
| GLUTAMAX | Fisher scientific | E3524T | |
| TRYPSIN 0.05% EDTA | Fisher scientific | E3513N | |
| EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| ETHYLENE GLYCOL, ANHYDROUS, 99.8%, | Sigma aldrich | ||
| Caco-2 cells | ATCC | ||
| PDMS | Dow corning | SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER | |
| Au (99.99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Chromium (99.95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Specialty Coating Systems | ||
| Ag/AgCl wire | HARVARD APPARATUS | ||
| Photoresist | CIPEC SPECIALITIES | Résine AZ9260 |
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