Dissection de<em> Xenopus laevis</em> Crête neurale pour<em> In vitro</em> Culture explantation ou<em> In vivo</em> Transplantation
Summary
Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.
Abstract
La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l'os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d'étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l'expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d'accueil pour l'étude de la migration et la différenciation NC in vivo.
Introduction
La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation. Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l'embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu'ils ont atteint leur destination finale, ils se différencient en une vaste gamme de produits dérivés, par exemple les neurones, les cellules gliales, les os, le cartilage et les cellules pigmentées 1-5. En raison de leur contribution à de nombreux types de cellules et de tissus embryonnaires, les défauts à toute étape du développement des cellules NC, de l'induction de la différenciation finale, peut provoquer des syndromes congénitaux nommés neurocristopathies 6. Emanipulation Xperimental de la NC en développement à différents stades – Spécification, EMT, de migration et de différenciation – permettra d'améliorer notre compréhension de neurocristopathies et permettre la conception de stratégies thérapeutiques potentielles.
L'embryon de Xenopus laevis est un modèle de choix pour étudier le développement NC. Un grand nombre d'embryons sont faciles à obtenir, et la fécondation externe donne accès aux toutes premières étapes du développement. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement X. laevis développement embryonnaire. Gain de fonction et knockdown gène sont faciles à effectuer par micro-injection de cellules individuelles de début blastulas. Tissus embryonnaires peuvent être coupés pour réassociation in vitro 7-11 ou tests de back-greffes 12,13.
Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer prémigratoire crânienne NC dans X. laevis neurulas fin, avant la migration. Ces explants peuvent être cultivées sur fibronectine coateplaques d pour étudier la migration et la différenciation en contrôlées in vitro conditions expérimentales. NC explants peuvent également être greffés sur des embryons normaux de l'hôte ou manipulées pour étudier leur migration et la différenciation in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d'embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d'exciser la crête neurale, à l'étape 17 et pas plus tard. Après l'étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne p…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Adeline Dolly pour les photos de expiant sur la fibronectine, Eric Theveneau pour des discussions utiles et dans les animaleries de l'Institut Curie. CM est un stage postdoctoral de la Région Ile de France (Domaine d'Intérêt Majeur souches Pole), Université Paris Sud (Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche), et l'Agence Nationale de la Recherche. Ce travail a été financé par l'Université Paris Sud (Attractivité 2011), le Centre National de la Recherche Scientifique (Programme d'Action Thématique et Incitative), Association pour la Recherche contre le cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le cancer, et l'Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).
Materials
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
| Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
| Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
| Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |
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