פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח פסגת premigratory גולגולת עצבית (NC) מneurulas laevis Xenopus. יכול להיות מצופה explants אלה בפיברונקטין ותרבית במבחנה, או מורכב בחזרה לעוברי מארח. טכניקה זו מאפשרת חקר המנגנונים של מעבר NC האפיתל לmesenchyme, הגירה, ובידול.
הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים בצינור עצבי הגבי חולפת שעוברת מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) בסוף neurulation, נודד בהרחבה לאיברים שונים, ומבדיל בסוגים רבים של מכשירים נגזרים (נוירונים, גליה, סחוס ועצם, תאי פיגמנט ומערכת האנדוקרינית). בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory מעוברי Xenopus laevis, במטרה ללמוד פיתוח NC in vivo ו במבחנה. מודל הצפרדע מציע יתרונות רבים ללמוד פיתוח מוקדם; קבוצות בשפע זמינות, עובר לפתח במהירות, in vivo רווח והפסד של אסטרטגיות פונקציה לאפשר מניפולציה של ביטוי גנים לפני לנתיחה NC בתורם ו / או עוברי מארח. יכול להיות מצופה explants NC בפיברונקטין ומשמש למחקרים במבחנה. הם יכולים להיות מתורבת במשך כמה ימים במדיום מוגדר חופשי בסרום. אנו גם מתארים כיצד להרכיב explants NC בחזרהלעוברי מארח לחקר נדידת NC ובידול in vivo.
הרכס העצבי (NC) הוא אוכלוסיית תאים עוברית חולפת העולה מהצינור העצבי בסוף neurulation בעוברי החולייתנים. אירועי האיתות וגנטיים המפקחים על מפרט NC להתחיל מוקדם ככל gastrulation. NC זו שצוין בגבול בין עצבי והאאקטודרם אינו עצבי על ידי אותות מרקמות גב שמסביב. בסופו של neurulation, תאי NC לעבור מעבר אפיתל לmesenchyme (EMT) ולהעביר בהרחבה בעובר בעקבות מסלולים סטריאוטיפיים על ידי היענות לרמזים המקיפים מנחים. ברגע שהם הגיעו ליעד הסופי שלהם, הם להתמיין למגוון רחב של מכשירים פיננסיים נגזרים, למשל תאי עצב, גליה, עצם, סחוס, ותאי פיגמנט 1-5. בגלל תרומתם לסוגי תאים רבים וברקמות עובריים, פגמים בכל שלב בהתפתחות תאי NC, מאינדוקציה להתמיינות סופית, יכול לגרום לתסמונות מולדים בשם neurocristopathies 6. Eהמניפולציה xperimental של NC הפיתוח בשלבים שונים – מפרט, EMT, הגירה, ובידול – תשפר את ההבנה של neurocristopathies ולאפשר עיצוב של אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות.
עובר laevis Xenopus הוא מודל של בחירה ללמוד פיתוח צפון קרוליינה. מספר גדול של עוברים הם קלים להשגה, והפריה חיצונית נותנת גישה לשלבים הראשונים של פיתוח. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני X. laevis התפתחות עוברית. גן רווח של פונקציה ומציאה קל לביצוע על ידי microinjecting תאים בודדים של blastulas המוקדם. רקמות עוברי ניתן לחתוך לאיחוד מחדש במבחנה 7-11 או מבחני גב השתלת 12,13.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לנתח את NC גולגולת premigratory בX. laevis מאוחר neurulas, לפני ההגירה. יכול להיות מתורבת explants אלה על פיברונקטין-coateצלחות ד ללמוד הגירה והבחנה שבשליטה בתנאי ניסוי מבחנה. יכול גם להיות מורכב explants NC לעוברי מארח נורמלים או מניפולציה כדי ללמוד ההגירה והבידול שלהם in vivo.
פרוטוקול זה מתאר טכניקה קלה explant NC גולגולת premigratory בעוברי laevis X.. העוברים המשמשים לניסויים כאלה צריכים להיות חזקים ולרפא היטב. לבטל את כל אצווה של עוברים בריאים. בנוסף, לגדול עוברים בטמפרטורות שונות (מ -12 ל 18-20 ° C), על מנת לכרות רכס עצבי בשלב 17 ולא מאוחר יותר. לאחר שלב 1…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים אדלין דולי לתמונות של explant על פיברונקטין, אריק Theveneau לדיונים מועילים ומתקן בעלי החיים של מכון קירי. CM הוא בחור דוקטורט של אזור איל דה פראנס (Domaine d'interet Majeur גזע פולני), אוניברסיטת פריז Sud (נספח ד 'הזמנית של Enseignement et de משוכלל ונדיר), וסוכנות ידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר. עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה לפריז Sud (Attractivite 2011), המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique (תכנית הפעולה Thematique et sur Incitative), איגוד לשפוך la משוכלל ונדיר contre le הסרטן גרנט SFI20101201882, Ligue contre le הסרטן, וסוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר התכנית בלאן).
Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F4759-1MG | |
Bovine Serum Albumine. Fraction V | Euromedex | 04-100-811-C | Lower quality grade may be suitable for this application |
Stainless Steel Insect Pins. Size 000 | FST | 26001 | |
Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm | FST | 11252-20 |