Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов
Summary
Мы опишем способ маркировать белка на поверхности живых нейронов использованием конкретного поликлональные антитела к эпитопам внеклеточных. Белок связаны антитела на поверхности клеток и впоследствии усвоены через эндоцитоз можно отличить от оставшихся на белок, или продают в, поверхности во время инкубации.
Abstract
Для того чтобы продемонстрировать клеточной поверхности локализацию предполагаемого рецептора трансмембранного в культивируемых нейронах, мы меченый белок на поверхности живых нейронов с конкретным первичного антитела против повышенной внеклеточной части белка. Учитывая, что рецепторы продают в и от поверхности, если клетки проницаемыми после фиксации затем оба клеточной поверхности и внутренний белок будет обнаружен тот же меченого вторичного антитела. Здесь мы адаптирован метод, используемый для изучения оборота белка ("кормления антитело") дифференциально метки белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело и белка, которые либо остались на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода . Способность различать эти два пула белка стало возможным благодаря включению ночного шага блокирующего с высококонцентрированных немеченного вторичным антителом после начального incubatioп unpermeabilized нейронов с флуоресцентно-меченого вторичного антитела. После стадии блокирования проницаемости нейронов разрешенных обнаружение интернализованной бассейн с флуоресцентным вторичным антителом, меченным другом флуорофора. Используя эту технику, мы смогли получить важную информацию о внутриклеточной локализации этого предполагаемого рецептора, показывая, что это было, действительно, продаются в поверхности клетки в нейронах. Эта методика широко применимы к ряду типов клеток и белков клеточной поверхности, обеспечивая соответствующее антитело с внеклеточным эпитопом доступен.
Introduction
При установлении функцию недавно идентифицированных белков, исследование субклеточном локализации и торговли белка в вопрос может дать важную информацию о вероятной роли / с белковой 1,2. Биоинформационный анализ транскриптома развивающегося неокортекса 3 предоставил нам список генов вл ющие экспрессию во время мыши мозга corticogenesis. Мы тогда приняли ген нокаут подход констатировать, что белок, кодируемый одной из этих генов, sez6, играет ключевую роль в развитии нейронов. Мы наблюдали, что ген, связанных с захватом 6, или Sez6, белок находится в развивающихся дендритов и также присутствует в дендритных шипов, специализированных структур на дендритах, которые получают и интегрируют возбуждающие сигналы. Кроме того, когда этот белок отсутствует, дендриты и возбуждающих синапсов сбоев в 4 образуют. Вероятной доминирующим изоформы белка имеет черты transmembranе рецептор хотя, когда внутриклеточное распределение белка immunolabeled была исследована с помощью конфокальной микроскопии или иммуноэлектронной микроскопии большинство, если не все, из сигнала оказалось, связанный с мелких пузырьков в somatodendritic отсека с небольшим или нет, белка меченного на плазматической мембране на клеточной поверхности.
Для того, чтобы окончательно показать, что это предполагаемый рецептор с предсказанной большой внеклеточного домена продают в плазматической мембране, мы использовали подход живых клеток с использованием антисыворотки мы сгенерированный к внеклеточной части белка для обозначения белка на клеточной поверхности. Объединив эту "антитело кормления" подход с двумя приложениями дифференциально-меченого вторичного антитела, разделенных широким шагом блокирующего и шаг пермеабилизации, мы смогли выделить два различных бассейнов белка, отличающихся путем связывания с флуоресцентной меченные вторичные антитела, помеченные разными fluorescЛОР теги. Таким образом, мы смогли выделить белок, который был усвоен эндоцитоза во время стадии инкубации антитело из белка, который либо оставалась на поверхности клетки или был предметом торговли на поверхность в течение этого периода. С помощью этого метода было установлено, что белок, представляющий интерес, продают в и из клеточной поверхности в нейронах. Таким образом, это относительно быстрый и простой метод оказался более информативным, чем традиционные методы иммуноцитохимии или предварительно вложения immunogold электронной микроскопии, несмотря на то, что мы использовали ту же кролик поликлональной антисыворотки для всех этих методов. Этот метод обычно применимы к любому трансмембранного белка при условии хорошей антитело, распознающее внеклеточные эпитопы домена доступен. Метод был использован ранее для изучения торговлей рецептора рецептора глутамата GluR1 субъединицы 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Техника, описанная здесь дополняет, что из клеточной поверхности биотинилирования (обзор Arancibia-Carcamo др..) 12, и это является методом выбора для сохранения информации о субклеточном локализации интернализованной белка, при условии подходящей первичное антитело к внеклеточный ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Teele Palumaa за помощь в цифрах. При финансовой поддержке Проекта Грант 1008046 от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета, Австралия.
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
- Lewis, T. L., Mao, T., Arnold, D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins. PLoS Biol. 9, (2010).
- von Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Gunnersen, J. M., Augustine, C., Spirkoska, V., Kim, M., Brown, M., Tan, S. -. S. Global analysis of gene expression patterns in developing mouse neocortex using serial analysis of gene expression. Mol. Cell. Neurosci. 19, 560-573 (2002).
- Gunnersen, J. M., Kim, M. H., et al. Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56, 621-639 (2007).
- Kennedy, M. J., Davison, I. G., Robinson, C. G., Ehlers, M. D. Syntaxin-4 Defines a Domain for Activity-Dependent Exocytosis in Dendritic Spines. Cell. 141, 524-535 (2010).
- Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
- Grabrucker, A., Vaida, B., Bockmann, J., Boeckers, T. M. Synaptogenesis of hippocampal neurons in primary cell culture. Cell Tissue Res. , 338-341 (2009).
- Vaillant, A. R., Zanassi, P., Walsh, G. S., Aumont, A., Alonso, A., Miller, F. D. Signaling mechanisms underlying reversible, activity-dependent dendrite formation. Neuron. 34, 985-998 (2002).
- Park, M., Penick, E. C., Edwards, J. G., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Recycling endosomes supply AMPA receptors for LTP. Science. 305, 1972-1975 (2004).
- Kennedy, M. J. &. a. m. p. ;., Ehlers, M. D. Organelles and trafficking machinery for postsynaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 29, 325-362 (2006).
- Lasiecka, Z. M., Yap, C. C., Caplan, S., Winckler, B. Neuronal early endosomes require EHD1 for L1/NgCAM trafficking. J. Neurosci. 30, 16485-16497 (2010).
- Arancibia-Cárcamo, I. L., Fairfax, B. P., Moss, S. J., Kittler, J. T., Kittler, J. T., Moss, S. J. Studying the localization, surface stability and endocytosis of neurotransmitter receptors by antibody labeling and biotinylation approaches. The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology. , (2006).
- Petrini, E. M., Lu, J., Cognet, L., Lounis, B., Ehlers, M. D., Choquet, D. Endocytic trafficking and recycling maintain a pool of mobile surface AMPA receptors required for synaptic potentiation). Neuron. 63, 92-105 (2009).
- Reider, A., Wendland, B. Endocytic adaptors – social networking at the plasma membrane. J. Cell Sci. 124, 1613-1622 (2011).
