ライブ培養神経細胞の抗体供給した後細胞表面および内在化タンパク質の異なる標識化
Summary
我々は、細胞外のエピトープに特異的なポリクローナル抗体を用いてニューロンを生体の表面上のタンパク質を標識するための方法を記載している。タンパク質、細胞表面上の抗体によって結合され、その後、エンドサイトーシスを介して内在化は、上の残りのタンパク質から区別、又はインキュベーション中に表面に輸送することができる。
Abstract
培養ニューロンにおける推定膜貫通受容体の細胞表面局在化を実証するために、我々は、タンパク質の細胞外部分に対して産生された特異的な一次抗体と生ニューロンの表面上のタンパク質を標識した。細胞を固定後、透過処理された場合の受容表面との間で売買されていることを考えると、両方の細胞表面と内部のタンパク質は、同じ標識された二次抗体によって検出される。ここでは、いずれかが細胞表面上に残存し、又は、この期間中に表面に輸送された抗体インキュベーション工程およびタンパク質の間にエンドサイトーシスによって内在化された標識タンパク質を示差的にするために、タンパク質輸送（「抗体送り」）を研究するために使用される方法を適合さ。タンパク質のこれらの2プールを区別する能力は、初期incubatio後、高濃度の非標識二次抗体と一晩ブロッキングステップを組み込むことによって可能になった蛍光標識された二次抗体と非透過ニューロンのN。異なる蛍光体で標識した蛍光二次抗体を用いて内部化プールの検出を可能にしたニューロンのブロッキング工程、透過処理の後に。我々はそれがあったことを明らかにし、この推定受容体の細胞内局在についての重要な情報を得ることができたこの技術を使用して、実際に、神経細胞における細胞表面に人身売買。この技術は、細胞外エピトープに適切な抗体を提供することが可能で、細胞型および細胞表面タンパク質の範囲に広く適用可能である。
Introduction
新たに同定されたタンパク質の機能を確立する上で、問題のタンパク質の細胞内局在や人身売買の調査は蛋白質の1,2の可能性のある役割/ Sについての重要な手がかりを提供することができます。開発新皮質3のトランスクリプトームのバイオインフォマティクス解析は、マウス脳corticogenesis中に変更発現を示す遺伝子のリストを提供してくれました。次に、これらの遺伝子のうちの1つ、sez6によってコードされるタンパク質は、ニューロンの発達に重要な役割を有することを確認するために遺伝子ノックアウトアプローチを採用した。私たちは、発作関連遺伝子6、またはSez6、タンパク質は樹状突起の開発に位置しており、また、樹状突起棘、受信して興奮シグナルを統合し、樹状突起上の特殊な構造中に存在していることを観察した。このタンパク質が不足している場合にさらに、樹状突起および興奮性シナプスが正しく4を形成することができない。タンパク質の考えが支配的アイソフォームはtransmembranの機能を備えていますE受容体は、免疫標識タンパク質の細胞内分布はほとんど共焦点顕微鏡によって、または免疫電子顕微鏡で調べたところ、が、全てではないが、信号の原形質膜上でラベルはほとんど、あるいは全く、タンパク質と細胞体のコンパートメントに小さな小胞に関連する登場細胞表面で。
明確に予測された大きな細胞外ドメインを有するこの推定上の受容体は原形質膜に輸送されることを示すために、我々は、細胞表面上のタンパク質を標識するタンパク質の細胞外部分に生成された抗血清を用いて生細胞のアプローチを採用した。広範なブロッキング工程および透過処理工程により分離示差的に標識された二次抗体の2つのアプリケーションは、この「抗体給餌」アプローチを組み合わせることで、異なるfluorescを有する蛍光標識二次抗体に結合することによって区別タンパク質の2つの異なるプールを識別することができたENTタグ。従って、我々は、細胞表面に残っまたはこの期間中に表面に輸送されたタンパク質のいずれかからの抗体のインキュベーション工程の間にエンドサイトーシスによって内在化されたタンパク質を区別することができた。この方法を用いて、関心対象のタンパク質が神経細胞で細胞表面との間で売買されていることを確立した。そのため、この比較的迅速かつ簡単な手法は、我々はすべてのこれらの技術に同じウサギポリクローナル抗血清を使用しているにもかかわらず、伝統的な免疫細胞化学法または事前に埋め込むイムノゴールド電子顕微鏡よりも多くの情報を証明した。この技術は、細胞外ドメインのエピトープを認識する優れた抗体が利用可能で提供される任意の膜貫通タンパク質に一般的に適用可能である。技術はグルタミン酸受容体のGluR1サブユニット5の受容体の輸送を研究するために以前に使用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載の技術は、（Arancibia-Càrcamo らによって検討）細胞表面ビオチン化12のものと相補的であり、それは内在化タンパク質の細胞内局在についての情報を保存するための選択方法であり、好適には一次抗体を設け細胞外エピトープは入手可能です。また、経時的なタンパク質輸送/内在化の定量は、タンパク質抽出物を調製する必要なく、（一次抗体と生細胞のイン?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、数字の支援についてTeele Palumaaに感謝します。国立保健医療研究評議会、オーストラリアからプロジェクト無償1008046によって資金を供給。
Materials
| PBS with Ca and Mg | Invitrogen | 14040182 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | PDS | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich Australia | A9418 | |
| Hank's balanced salt solution without calcium, magnesium, phenol red | Invitrogen (Gibco) | 14175-079 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich Australia | P0899 | |
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | Thaw on ice prior to making aliquots |
| Fetal bovine serum HyClone | Thermo Fisher | ||
| fluorodeoxyuridine | Sigma Aldrich Australia | F0503 | |
| uridine | Sigma Aldrich Australia | U3003 | |
| 18 mm round glass coverslips | Menzel Gläser | CB00180RA1 | |
| VECTASHIELD aqueous mounting medium | Vector Laboratories | H1400 | |
| Donkey anti-rabbit Dylight 649 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-495-152 | |
| AffiniPure Fab fragment Goat anti-Rabbit 1gG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-007-003 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich Australia | P6148 | TOXIC – handle in fume hood |
| Triton-X-100 | Sigma Aldrich Australia | T8787 | |
| Alexafluor 488-conjugated donkey anti-rabbit 2° antibody | Invitrogen – Molecular Probes | A21206 |
References
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