在这段视频中,我们演示了解剖小鼠 跨性别腹肌 的方案,并使用免疫荧光和显微镜来可视化神经肌肉结。
神经肌肉结点形态分析可以对给定运动神经元的生理状态有重要的洞察力。与传统上使用的较厚的肌肉(如后肢肌肉)的肌肉(例如) 胃肠)。细小的肌肉可以全面概述给定肌肉的整个内向模式,这反过来又允许识别有选择地脆弱的运动神经元池。这些肌肉还允许分析参数,如运动单元大小、轴向分支和末端/节点发芽。使用这种肌肉的一个常见障碍是获得技术专长来解剖它们。在这段视频中,我们详细介绍了解剖幼鼠 跨性别abdominis (TVA) 肌肉和进行免疫荧光以可视化轴突和神经肌肉结 (NMJs) 的协议。我们证明,这项技术提供了TVA肌肉内向模式的完整概述,并可用于研究NMJ病理学在小鼠模型的儿童运动神经元疾病,脊髓肌肉萎缩。
神经肌肉结 (NMJs) 是下运动神经元和骨骼肌纤维之间的突触连接。他们传统上被认为是一个三方突触,由神经元(先天性末梢),肌肉纤维(后突触终端)和终端施万细胞1组成。NMJs似乎是早期和重要的病理学目标在一系列运动神经元疾病和小鼠模型2,3。典型的症状包括衰减,其中运动端板变得缺乏先天性内向,前突末端肿胀,以及NMJ形态4-11的复杂性降低。补偿性响应也可以注意到,其中包括终端和节点发芽,其中轴突过程从剩余的突触终端或内分节延伸到重新插入的解压端板12,13。由于突触活性和NMJ形态学之间的紧密相关性,从NMJ形态学分析中可以获得大量有关运动神经元的功能状态的信息。由于NMJ的丧失经常是神经肌肉病理学4,10的最初方面之一,内在程度的定量可以提供有关病理学进展和治疗干预的潜在效果的重要信息。此外,由于NMJ损失是病理进展的重要一步,开发能够稳定联系和鼓励再生的治疗方法可能会产生显著的好处。
在分析NMJ形态时,肌肉选择非常重要。一些主要考虑因素可能包括肌肉纤维类型、身体状况和与人类状况的比较分析。此外,如果需要注射物质或创伤性神经损伤等操作,实验性可及性也很重要。一般来说,最好分析一系列肌肉定位在整个身体反映了一系列运动单位亚型。然而,肌肉选择往往受到解剖方便的影响。因此,NMJ分析通常只对胃内膜等大型血管肌肉进行。为了在这种肌肉中获得良好的 NMJ 染色,通常需要断断或机械破坏肌肉纤维。因此,内向模式可能中断,对内向模式、发芽和衰减的全面和高质量的分析往往受到损害。另一种方法是使用不需要分割的薄扁平肌肉,可以完整地染色和安装,从而全面概述肌肉的整个内脏。有许多肌肉可用于这样的分析,包括一组颅肌,(包括悬浮器奥里斯龙格斯,血管优越,和加法器奥里斯朗格斯)14,胸肌(如.三角形斯特尼)15, 和腹部 (如横向腹部肌 (TVA) 肌肉。使用这种肌肉的主要障碍是解剖这些肌肉而不需要任何损伤所需的技术专长。
在这段视频中,我们提供了一个协议,从小鼠身上解剖和执行TVA肌肉的免疫荧光标记,以便全面分析内向模式和NMJ形态。TVA肌肉是一种以缓慢抽搐为主的肌肉,由腹部肌肉的最深处组成,内侧由下层间神经组成。先前的工作已经表明,它一直非常容易受到病理学在一些小鼠模型的儿童运动神经元疾病脊髓肌肉萎缩(SMA)和其他小鼠模型的早期发病运动神经元退化4,16。因此,我们建议TVA是进行NMJ分析外周神经病变的有用肌肉。
在这段视频中,我们详细介绍了从小鼠身上解剖TVA肌肉以及肌肉内NMJs全山免疫荧光标签的协议。我们还提供的数据表明,这种肌肉可用于分析SMA小鼠模型中的神经肌肉结点病理学。
这项技术的成功取决于许多因素。下面概述了一些最常见的问题。首先:免疫化学污渍不良。原因有很多,其中最常见的一个是使用与本协议中列出的试剂不同的试剂。高质量的电子显微镜级 PFA 对于确保良好的染色非常重要,本协议中列出的抗体选择也非常重要。此外,在较老的动物(即>3个月),获得良好的质量染色可能更加困难。这是因为肌肉周围的筋膜厚度增加,外部斜面和 转子之间的 脂肪积累增加。在开始免疫荧光之前,去除脂肪很重要。它可能也有必要剥离一些覆盖肌肉的筋膜,这可能会变厚。有时很难从肌肉中去除筋膜和脂肪,而不会对肌肉纤维造成一些损伤,并破坏内侧的内侧模式。但是,如果仔细执行此技术,则至少可以从 1 岁以下的小鼠身上获得高质量的染色。在幼鼠(即小于3个月大)中,没有必要进行任何肌肉纤维的戏弄或分离。其次:在解剖和染色后很难找到NMJ。这通常是因为解剖没有在最后一根肋骨下面延伸。大多数NMJ位于最后一根肋骨的正下方,因此必须小心确保肌肉的这一部分被纳入解剖。第三:将EO肌肉粘在TVA肌肉上。当个人试图将解剖范围扩展到内部斜面 (IO) 肌肉水平以下时,这通常是一种抱怨。IO 也存在的 TVA 肌肉区域更难分析,因为很难区分哪种肌肉是哪种肌肉。因此,我们通常只是解剖TVA肌肉最优越的部分。在这个水平上,EO 和 TVA 肌肉之间没有粘性,因此这应该不是一个严重的问题。
与血管外肌肉相比,使用TVA肌肉的一个重要障碍是手术操作或注射物质的可及性。这些类型的实验对于研究给定肌肉中的NMJ生理学至关重要。虽然TVA肯定比更常用的肌肉,如 头骨前 或 胃内分,更容易获得,以前的工作已经表明,有可能通过手术损伤的间骨神经18使TVA脱神经。我们最近还使用这种肌肉对全身麻醉下的物质进行局部管理(未公布的数据)。虽然这些实验可以代表一个适度的技术挑战,这项工作表明,他们是可行的,从而扩大这种肌肉的效用分析NMJ在病理和生理操纵。
TVA 肌肉是位于全身的众多薄扁平肌肉之一,可用于对内向模式进行全安装分析。其他肌肉包括一组颅骨肌肉,由来自脑干面部核心的运动神经元内侧,包括 高悬浮器奥里斯龙格斯, 血管优越,和 加法器奥里斯朗格斯,解剖之前已经描述14,19。此外,TVA肌肉周围的肌肉,包括EO,IO和 直肠腹膜,也可以标记和用于NMJ分析。对于小鼠模型中的 NMJ 病理学进行综合分析,必须考虑位于全身的一些肌肉,而不是将分析限制在单个肌肉上。这表现在运动神经元疾病的小鼠模型中,其中不同肌肉之间NMJ病理学水平存在显著的异质性。这种肌肉间变异性是研究运动神经元脆弱性机制时极其有价值的工具,因此将分析限制在单个肌肉上会显著降低研究的潜力。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了加拿大卫生研究所(赠款编号澳门币38040)向R.K.、肌肉萎缩协会(美国)向R.K.、SMA家庭向R.K.和L.M.M、SMA信托基金向T.H.G.和肌肉萎缩运动向T.H.G.提供的赠款的支持。L..M.M是加拿大多发性硬化症学会博士后奖学金的接受者,R.K.是渥太华大学健康研究主席的接受者。
Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% ) | Electron Micropscopy Sciences | 15700 | |
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Minutien Pins | Fine science tools | 26002-20 | |
α-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | B-13422 | |
Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A4503 | |
Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-166-003 | |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Slides (Superfrost Plus; White) | Fisher | 12-550-15 | |
Coverslips | Fisher | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
CD1/C57Bl6 mouse | Jackson Labs |