Visualizzazione neuroblasti Citocinesi Durante<em> C. elegans</em> Embriogenesi

Summary

Questo protocollo descrive come immagine divisione delle cellule all'interno di un tessuto in Caenorhabditis elegans embrioni. Mentre diversi protocolli descrivono come la divisione cellulare l'immagine in embrione precoce, questo protocollo viene descritto come immagine divisione cellulare all'interno di un tessuto in via di sviluppo durante la metà tarda embriogenesi.

Abstract

Questo protocollo descrive l'uso di microscopia a fluorescenza a immagine divisione delle cellule all'interno di sviluppare Caenorhabditis elegans embrioni. In particolare, questo protocollo si concentra su come un'immagine dividendo neuroblasti, che si trovano sotto le cellule epidermiche e possono essere importanti per epidermico morfogenesi. Formazione di tessuto è cruciale per lo sviluppo metazoi e si basa su stimoli esterni da tessuti vicini. C. elegans è un ottimo organismo modello per studiare morfogenesi dei tessuti in vivo a causa della sua trasparenza e semplice organizzazione, rendendo i tessuti facile da studiare tramite microscopia. Contenitore ventrale è il processo in cui la superficie ventrale dell'embrione è coperto da un singolo strato di cellule epiteliali. Questo evento è pensato per essere facilitato dai neuroblasti sottostanti, che forniscono spunti di orientamento chimica di mediare la migrazione delle cellule epiteliali sovrastanti. Tuttavia, i neuroblasti sono altamente proliferative, oppure possono agirecome substrato meccanico per le cellule epidermiche ventrali. Gli studi che utilizzano questo protocollo sperimentale potrebbe scoprire l'importanza della comunicazione intercellulare durante la formazione del tessuto, e potrebbero essere utilizzati per rivelare i ruoli dei geni coinvolti nella divisione cellulare nei tessuti in via di sviluppo.

Introduction

Mentre ci sono protocolli che descrivono come la divisione cellulare immagine nei primi C. elegans embrione, questo protocollo viene descritto come la divisione cellulare l'immagine all'interno di un tessuto durante la metà embriogenesi. Una delle principali sfide nel campo dell'imaging organismi in fase di sviluppo è stata la loro sensibilità alla fototossicità. Tuttavia, una maggiore accessibilità alle filatura microscopio confocale disco o microscopi campo spazzato ha permesso applicazioni di imaging più diffuse. Entrambi i sistemi utilizzano laser a stato solido e luce diffusa, limitando i livelli di UV che gli organismi sono esposti. Tuttavia, stand widefield possono ancora essere utilizzati per l'imaging in vivo, soprattutto se è provvisto di telecamere ad alta sensibilità (ad esempio EMCCD), controllo di apertura e di controllo della luce (ad esempio LED o lampade al mercurio regolabili). Questo protocollo descrive come utilizzare sia un sistema confocale o basato su un sistema widefield di divisione cellulare immagine all'interno di sviluppo C. elegans </ Em> embrioni. A titolo di esempio, descriviamo come immagine divisione cellulare neuroblasti. Neuroblasti possono facilitare epidermica morfogenesi fornendo segnali chimici o meccanici per le cellule epidermiche sovrastanti, e fornire un eccellente esempio dell'importanza della comunicazione intercellulare nella formazione dei tessuti.

Caenorhabditis elegans è un organismo modello ideale per studi basati microscopia essendo trasparente e semplice organizzazione tessuto ^1. Inoltre, C. elegans è suscettibile di metodi genetici e RNAi, e dal momento che molti dei suoi geni hanno omologhi umani, può essere utilizzato per identificare i meccanismi conservati per formazione di tessuto ^2-5. In C. elegans, la formazione dell'epidermide avviene in media embriogenesi, quando l'embrione ha> 300 cellule. Epidermal morfogenesi consiste di diverse fasi principali, durante il quale l'embrione è racchiuso in uno strato di cellule epidermiche che restringono e si estendono per trasformare il embryo da una forma ovoidale nella forma allungata di una vite senza fine ^6. Contenitore ventrale descrive uno di questi eventi morfogenetici, quando le cellule epidermiche ventrali migrano verso la linea mediana ventrale per coprire la superficie ventrale dell'embrione (Figura 1). In primo luogo, due coppie di anteriori situato cellule Leading Edge migrano verso la linea mediana ventrale, dove aderiscono e si fondono con i loro vicini controlaterale ^6. Questa è seguita da migrazione delle cellule posteriori situato tasca, che formano cuneo come forme creando una tasca ventrale ^6-7. Il meccanismo che chiude la tasca non è ben compreso. Una possibilità è che una struttura di actina miosina contrattile sovracellulari lega le cellule tasca insieme in una stringa di borsa come la moda, simile alla guarigione delle ferite ^8. È interessante notare che la migrazione di alcune delle cellule tasca è mediata da specifici sottoinsiemi di neuroblasti sottostanti ⁹ (precursori neuronali che si trovano sotto il epidermis; Figura 1B).

Studi precedenti hanno mostrato che i neuroblasti regolano ventrale migrazione delle cellule epidermiche e contenitore ventrale. VAB-1 (recettore Ephrin) e VAB-2 (Ephrin ligando) sono altamente espresso nei neuroblasti e facilitare lo smistamento delle anteriori e posteriori neuroblasti uno dall'altro, e mutazioni nel VAB-1 o VAB-2 causa custodia ventrale fenotipi ^10-13. Tuttavia, gli esperimenti di soccorso Promotore mostrato che è richiesta anche VAB-1 nelle sovrastanti cellule epidermiche ventrali e recettori per altri segnali di orientamento secreti dai neuroblasti sono espressi nelle cellule epidermiche ventrali ^9. Anche se le mutazioni in nessuno di questi recettori causano fenotipi recinzione ventrale, non è chiaro se i difetti sorgono a causa di problemi nel posizionamento neuroblast o dovuti a mancanza delle cellule epidermiche ventrale per rispondere alle linee guida spunti ^14. Alterare la divisione dei neuroblasti wiThout alterano la capacità di secernere spunti di orientamento potrebbe far luce sul ruolo dei neuroblasti e la loro capacità di fornire un contributo meccanica durante la morfogenesi epidermica. Recentemente, è stato scoperto che un gene divisione cellulare, ani-1 (anillin) è altamente espresso in neuroblasti (Figura 2A) e il suo esaurimento causa difetti divisione neuroblasti. È interessante notare che questi embrioni mostrano ventrali fenotipi di recinzione (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate).

Anillin è necessaria per la divisione cellulare, e in particolare per citochinesi, che descrive il processo in cui una cellula madre si divide fisicamente in due cellule figlie. Citochinesi è guidato dalla formazione di un anello contrattile actomyosin, che deve essere strettamente controllato nello spazio e nel tempo per assicurare che esso sia correttamente accoppiato con cromatidi fratelli segregazione. Il principale regolatore della citochinesi metazoi è RhoA (RHO-1 in C. elegans), una piccola GTPasi che è unctive nella sua forma GTP-bound. Il GEF Ect2/ECT-2 attiva RhoA, dopo di che RhoA-GTP interagisce con effettori a valle che formano l'anello contrattile e mediano suo ingresso di ^15. Anillin è una proteina che si lega a più dominio di RhoA tramite il suo C-terminale e di actina e miosina attraverso il suo N-terminale. Anillin è necessario per stabilizzare la posizione dell'anello contrattile in cellule di mammifero o Drosophila S2 ^16. Anillin esaurimento provoca anelli contrattili a subire oscillazioni laterali, e cytokinesis alla fine non riesce formando cellule multinucleate ^17-19. Curiosamente, sebbene C. elegans ani-1 Coordinate actomyosin contrattilità in embrione precoce, ma non è essenziale per la citochinesi. Tuttavia, come sopra descritto, è necessario ani-1 per neuroblast citochinesi durante la metà embriogenesi (Fotopoulos, Wernike e Piekny, osservazioni non pubblicate). Fallimento Citocinesi altererebbe il numero e la posizione dei neuroblasti e potrebbe influenzare il loczione dei segnali di orientamento chimici, o potrebbe alterare le proprietà meccaniche del tessuto. Entrambi i modelli evidenziano il ruolo non autonomo di neuroblasti per custodia ventrale, e l'importanza della comunicazione tessuto dei tessuti durante lo sviluppo embrionale.

Questo protocollo sperimentale descritto come la divisione cellulare immagini durante la C. elegans metà embriogenesi usando la microscopia a fluorescenza. La maggior parte degli esperimenti che studiano i meccanismi di divisione cellulare sono stati eseguiti in singole cellule all'interno piastre di coltura (per es. HeLa o cellule S2) o in embrioni precoci con un numero limitato di cellule (ad esempio C. elegans embrione unicellulare, Xenopus, o echinoderm embrioni). Tuttavia, è importante studiare la divisione cellulare nei tessuti, in quanto vi sono segnali esterni che possono influenzare la sincronizzazione e il posizionamento del piano di divisione. Inoltre, le cellule possono fornire segnali chimici o meccanici di influenzare lo sviluppo del tessuto limitrofos, ed è importante capire come la comunicazione intercellulare aiuta a formare tessuti durante lo sviluppo.

Protocol

1. Preparazione di piatti per il mantenimento Ceppi Worm and Performing RNAi Piatti nematode crescita media Piatti Preparare piatti Nematode crescita media (NGM) per mantenere i ceppi di vermi e di eseguire incroci genetici. Combinare 3 g NaCl, 17 g Agar e 2,5 g BactoPeptone con 1 L di acqua distillata in un pallone da 2 L e aggiungere un agitatore metallo. Autoclavare il pallone per sciogliere l'agar e per sterilizzare media. Quindi mettere il pallone su un piatto mescolare e …

Representative Results

Questo protocollo sperimentale descritto come immagine divisione cellulare in C. elegans embrioni in media embriogenesi. In particolare, si descrive come neuroblasti immagine, che può facilitare epidermica morfogenesi. Epidermal morfogenesi verifica a causa di una combinazione di cambiamenti di forma delle cellule epidermiche, la migrazione e l'adesione, ma anche si basa su segnali chimici o meccanici dai neuroblasti sottostanti (Figura 1B). I neuroblasti secernono spunti di orientamento c…

Discussion

Questo protocollo descrive l'uso di vari tipi di microscopia a divisioni cellulari immagine in media embriogenesi. In particolare, questo protocollo evidenzia come immagine la divisione dei neuroblasti, cellule che possono facilitare epidermica morfogenesi. Comunicazione cellula-cellula è importante per la formazione di tessuto durante lo sviluppo metazoi e C. elegans è un modello eccellente per studiare la formazione di tessuto in vivo. Un evento che ritrae bene l'interazione dei tessuti è …

Materials

Agar	BioShop Canada Inc.	#AGR001.1	For making C. elegans NGM and RNAi plates
Agar	Bio Basic Inc.	#9002-18-0	For making bacteria LB agar plates
Agarose	BioShop Canada Inc.	#AGA001.500
Anti-mouse Alexa 488 antibody	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11029
Anti-mouse anti-GFP antibody	Roche Applied Science	#11814460001
Anti-rabbit Alexa 568 antibody	Life Technologies Corporation (Invitrogen)	#A11011
Ampicillin	BioShop Canada Inc.	#AMP201.5	Store powder at 4 °C and dissolved ampicillin at -20 °C
Bactopetone  (peptone-A)	Bio Basic Inc.	#G213
CaCl2 (calcium chloride)	BioShop Canada Inc.	#C302.1
Cholesterol	BioShop Canada Inc.	#CHL380.25	Dissolve in ethanol
DAPI	Sigma-Aldrich	#D9542	Use to stain nucleic acids (DNA)
Glycerol	BioShop Canada Inc.	#GLY001.1
IPTG (isopropylthio-β-galactoside)	Bio Basic Inc.	#367-93-1	Store powder and dissolved IPTG at -20 °C
KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic)	BioShop Canada Inc.	#PPM666.1
K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic)	BioShop Canada Inc.	#PPD303.1
L4440  (feeding vector)	Addgene	#1654	Keep as glycerol stock at -80 °C
MgSO4   (magnesium sulfate)	BioShop Canada Inc.	#MAG511.500
NaCl (sodium chloride)	Bio Basic Inc.	#7647-14-5
Na2HPO4 (sodium phosphate, dibasic)	Bio Basic Inc.	#7558-79-4
Normal Donkey Serum (NDS)	Wisent Bioproducts	#035-110
n-propyl 3.4.5-trihydroxybenzoate (propyl gallate)	Alfa Aesar	#A10877
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	#P8920	For optimal results coat microscope slides three times
Streptomycin	BioShop Canada Inc.	#STP101.50	Store powder at 4 °C and dissolved streptomycin at -20 °C
Tetracyclin	BioShop Canada Inc.	#TET701.10	Store powder at 4 °C and dissolved tetracycline at -20 °C
Tween-20	Bio Basic Inc.	CAS#9005-64-5
Tryptone	BioShop Canada Inc.	#TRP402.500
Yeast Extract	Bio Basic Inc.	#8013-01-2