FIBS功能的无创性代谢轮廓
Summary
如何在原位代谢轮廓校正共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于描述呈现。该FIBS可用于测量非侵入性代谢物辅助的代谢模式和生物过程条件的高通量筛选的发展的细胞内水平。
Abstract
在计算生物学的时代，新的高通量实验系统是必要的，以便填充和完善的模型，使他们能够进行预测进行验证。理想的情况是这样的系统将是低量，这就排除了采样和破坏性的分析时，时间过程的数据将被获取。所需要的是一种在原位监测工具，它可以在实时和非侵入性地报告必要的信息。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为细胞内浓度的记者。已经发现应用中代谢物的定量一个特定类的体内生物传感器是基于共振能量转移（FRET）的配体结合结构域连接的两个荧光蛋白之间。 FRET集成生物传感器（FIBS）细胞系中都产生组成，他们有快速的响应时间和他们的茶谱根据代谢物在细胞内的浓度特性的研究改变。在本文中，该方法用于构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为葡萄糖和谷氨酰胺和校准体内批次细胞培养物中FIBS以使胞内代谢物浓度的将来量化进行说明。从进料 – 分批的CHO细胞培养数据表明，FIBS能够在每种情况下，检测在细胞内的浓度所产生的变化。使用从FIBS和先前构建的校准曲线的荧光信号，细胞内浓度，精确地确定所确认的独立酶法测定。
Introduction
代谢物监测在生物加工各种应用，包括工艺开发，媒体和饲料的设计，以及代谢工程。各种方法可用于浓度测量通过使用酶1，化学2，或结合试验3。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为关键代谢产物的细胞内浓度的记者。在超低量测定法，荧光是一种方便的工具，如小型化实际上是改善了信号-噪声比4,5和蛋白为基础的传感器可遗传编码的意义，没有外源试剂是必需的代谢物的分析。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器包括一个配体结合域连接的两个荧光蛋白。 FRET是能量从光激发捐助者的一个非辐射转移到受体荧光分子要价较高，编接近（<100）。配体的裂解或结合引起的构象变化的传感器，其中，反过来，诱导的荧光基团的接近而变化，导致通过在发光光谱的变化测定FRET效率的变化。 FRET集成生物传感器（FIBS）的细胞系中是组成型产生的和它们的光谱特性改变的基础上代谢物在细胞内的浓度。 FIBS具有快速响应时间使它们非常适合进行测量的动态模型6。以前的应用包括监测单7-9和10多个代谢物，以及提供有关时空分布11个数据。载脂蛋白最大，其中配体结合打乱降低能量传递和载脂蛋白民，其中配体结合所带来的两个荧光基团成更紧密的接触（ 图1）的荧光团的接近：FIBS可以在两种配置中创建。
_content“>在这项工作中，一个协议，提出构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为代谢物，葡萄糖或谷氨酰胺，一种方法是建立在传感器体 内的校准，以使将来的定量胞内代谢物浓度的测量，如示于图2。基于此，葡萄糖或谷氨酰胺的细胞内浓度可在补料分批的CHO细胞培养物测定中，向其中两种养分中加入高浓度的过程，其结果证明由FIBS和先前构建的校准曲线使用的荧光信号，准确预测细胞内浓度是可能的，并经一个独立的酶法测定，该方法提供了超过当前的分析技术显着的优点，因为它是无创的，低成本的快，给，可在星期一FIBS的实时信号itored整个文化。Protocol
Representative Results
Discussion
该FIBS使在体内和关键分子原位定量，在这种情况下生长限制性营养物质，除去从淬火和提取方法所产生的不确定性。调查结果表明，有在FIBS信号和细胞内浓度在1-5毫米的范围内葡萄糖和0.3-2mm的谷氨酰胺之间的良好关系。在批量的CHO细胞培养中，这些浓度中的指数，固定的，并且早下降阶段遇到的问题。该指数相和固定相是最关键的适宜喂养策略的设计方面，因此使用这些生物传感?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢狼Frommer教授（卡内基科学研究所，斯坦福大学）的好心为我们提供的葡萄糖FRET质粒和乌韦Ludewig博士（霍恩海姆大学）的亲切供应谷氨酰胺FRET构建在pUTKan植物表达载体。 AB公司是由BBSRC针对性的优先级奖学金计划提供资金。既CK和KP是由英国研究理事会奖学金的生物制药工艺的支持。 CK还要感谢龙沙生物提供财政支持。该中心为合成生物学与创新是慷慨由EPSRC支持。
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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