Immunofluorescence indirecte (IFI) les essais ont traditionnellement été utilisés pour la détection des anticorps antinucléaires (ANA) dans le sérum humain. La présence de ces anticorps peut aider au diagnostic de maladies rhumatismales auto-immunes systémiques (ADRD). Ce protocole montre comment effectuer efficacement la technique IIF pour détecter avec précision ces auto-anticorps.
L'American College of Rheumatology énoncé de position sur les tests ANA prévoit l'utilisation de l'IIF que la méthode de l'étalon-or pour le dépistage ANA 1. Bien IIF est un excellent test de dépistage dans des mains expertes, les difficultés techniques de traitement et de lecture IIF glisse – comme la intensif de traitement du travail de diapositives, une lecture manuelle, la nécessité d'une expérience, les technologues formés et l'utilisation de la salle sombre – rendre la méthode IIF difficile de faire entrer dans le flux de travail de laboratoires automatisés, modernes.
La première étape cruciale vers la haute qualité dépistage ANA est le traitement de diapositive attention. Cette procédure est laborieuse et nécessite une bonne compréhension du processus, ainsi que l'attention aux détails et l'expérience.
Glisser lecture est effectuée par microscopie à fluorescence dans des pièces sombres, et se fait par des techniciens qualifiés qui sont familiers avec les différents modèles, dans le cadre du cycle cellulaireet la morphologie de l'interphase et les cellules en division. À condition que l'IIF est le premier outil de dépistage de la ligne pour l'ADRD, comprendre les étapes à exécuter correctement cette technique est critique.
Récemment, des systèmes d'imagerie numérique ont été développés pour la lecture automatique des diapositives IIF. Ces systèmes, tels que le NOVA Voir microscope à fluorescence automatisé, sont conçus pour faciliter le travail IIF routine. NOVA Voir acquiert et stocke les images numériques de haute résolution des puits, séparant ainsi l'acquisition d'images à partir de l'interprétation; images sont visualisées sur une interprétation d'un des écrans d'ordinateur à haute résolution. Il stocke les images pour référence future et prend en charge l'interprétation de l'opérateur en fournissant des données d'intensité de lumière fluorescentes sur les images. Il classe également au préalable les résultats positifs ou négatifs, et fournit une reconnaissance de motif pour les échantillons positifs. En résumé, il élimine le besoin de chambre noire, et automatise et rationalise le readi IIFng / flux de travail d'interprétation. Surtout, il augmente la cohérence entre les lecteurs et les lectures. De plus, avec l'utilisation de diapositives à code-barres, les erreurs de transcription sont éliminés en fournissant la traçabilité des échantillons et l'identification positive du patient. Il en résulte l'intégrité des données du patient et de sécurité accrue.
L'objectif global de cette vidéo est de démontrer la procédure IIF, y compris le traitement de diapositives, l'identification de modèles IIF communes, et l'introduction de nouvelles avancées pour simplifier et harmoniser cette technique.
L'anticorps antinucléaires terme (ANA) décrit une variété d'auto-anticorps qui réagissent avec les constituants des noyaux de cellules dont l'ADN, des protéines et ribonucléoprotéines 1, 2. La cellule HEp-2, une matrice de protéine native avec des centaines d'antigènes, fournit un substrat idéal pour la détection d'une ANA. La détection de l'ANA dans le sérum humain est un outil de dépistage important pour les maladies du tissu conjonctif, et IIF est la méthode de référence pour tester ANA 1. Récemment, IIF sur cellules HEp-2 a été remplacé dans certains laboratoires avec des dosages immunologiques spécifiques de l'antigène et méthodes multiplex. En raison de préoccupations au sujet des résultats faussement négatifs et le manque de transparence pour les cliniciens, l'American College of Rheumatology a formé un groupe de travail qui a conclu que l'aide IIF cellules HEp-2 devrait être le «gold standard» pour le dépistage ANA 1.
En raison de la nature subjective de criblage ANA, la qualité des cellules HEp-2 est enintégrante de rapports précis et sûr des résultats. La présence d'un nombre élevé de cellules en mitose, la morphologie cellulaire optimale, la confluence suffisante, et l'expression des antigènes en question sont particulièrement importants. Reconnaissance de formes IIF sert comme un outil important pour aider au diagnostic du patient. Comprendre l'importance de divers modèles permet aux cliniciens et le personnel de laboratoire pour effectuer les essais de suivi approprié pour confirmer le diagnostic. Par exemple, le motif ANA homogène peut se produire en présence d'anticorps anti-ADN double brin chromatine ou, et peut être associé à un lupus érythémateux disséminé (SLE) 3. De l'autre côté, il a été récemment décrit que la configuration dite fine et dense mouchetée (DFS) qui est couramment observée jusqu'à 12% des échantillons de routine, a surtout été associée à des anticorps anti-DFS70. Ces auto-anticorps, une fois trouvé dans l'isolement (sans autre ANA spécifique de la maladie) ne sont pas associés à des maladies rhumatismales auto-immunes systémiques <sup> 4-9. Tests de confirmation de ce fait pour les anticorps anti-DFS70 peut aider à réduire les tests de réflexe inutile, offrir des économies considérables, et soulager l'anxiété du patient.
Étant donné que l'IIF est la première méthode de dépistage de la ligne pour détecter des auto-anticorps, il est primordial que l'utilisateur comprenne comment le choix des réactifs et des substrats de tissus peut influer sur les résultats. Depuis la technique IIF est intrinsèquement subjective, il est important que les réactifs utilisés fournissent les résultats de la plus haute qualité.
Cet objectif de ce protocole vidéo est de familiariser l'utilisateur avec les bonnes mesures nécessaires pour exécuter la méthode IIF, les modèles communs associés à ANA, et d'introduire de nouvelles avancées qui peuvent rationaliser le flux de travail de laboratoire et de normaliser les résultats.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Cassandra Bryant pour effectuer l'expérience IIF et Carol Büchner pour son examen technique d'experts.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
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