פלטפורמת microfluidic למדידת נויטרופילים Chemotaxis מדם מלא לא מעובד
Summary
פרוטוקול זה מפרט assay נועד למדוד chemotaxis נויטרופילים אדם מטיפה אחת של דם מלא עם שחזור חזק. גישה זו עוקפת את הצורך בהפרדת נויטרופילים ודורשת זמן הכנת assay רק כמה דקות. שבב microfluidic מאפשר למדוד החוזרים ונשנים של chemotaxis נויטרופילים לאורך זמן בתינוקות או יונקים קטנים, שבו נפח דגימה מוגבל.
Abstract
נויטרופילים לשחק תפקיד חיוני בהגנה מפני זיהומים ומספרם בדם בתדירות גבוהה שנמדדו במרפאת. ספירת נויטרופילים גבוהה בדם הן בדרך כלל אינדיקטור של זיהומים מתמשכים, בעוד שספירת נויטרופילים נמוכה הן תמרור אזהרה לסיכון גבוה יותר לזיהומים. כדי להשיג את הפונקציות שלהם, נויטרופילים גם צריכים להיות מסוגל לנוע ביעילות מהדם שבו הם מבלים את רוב חייהם, לרקמות, שבו זיהומים להתרחש. כתוצאה מכך, פגמים ביכולת של נויטרופילים לנדוד יכולים להגדיל את הסיכונים לזיהומים, גם כאשר הנויטרופילים נוכחים במספרים מתאימים בדם. עם זאת, מדידת יכולת נדידת נויטרופילים במרפאת היא משימה מאתגרת, וזה זמן רב, דורש כמות גדולה של דם, ואת ידע של מומחה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, עיצבנו מבחני microfluidic חזקים להגירת נויטרופילים, אשר דורש טיפה אחת של דם לא מעובד, נסיבותהפתחים את הצורך בהפרדת נויטרופילים, והוא קל לכמת על מיקרוסקופ פשוט. ב assay זה, נויטרופילים להעביר ישירות מטיפת הדם, בערוצים קטנים, לכיוון המקור של chemoattractant. כדי למנוע את הזרימה הפרטנית של תאי דם אדומים באמצעות אותם הערוצים, יישמנו מסננים מכאניים עם זווית נכונה הופך באופן סלקטיבי לחסום מראש של תאי דם אדומים. אנחנו תוקף את assay ידי השוואת נדידת נויטרופילים מטיפי דם שנאספו מדקירת אצבע ודם ורידים. אנחנו גם בהשוואה הדם כל אלה מקורות (WB) בנדידת נויטרופילים מדגימות של נויטרופילים המטוהרים ומצאנו במהירות עקבית ויווניות בין שלושה המקורות. פלטפורמת microfluidic זה תאפשר חקר נדידת נויטרופילים אנושי במרפאת והגדרת המחקר כדי לעזור לקדם את ההבנה של פונקציות נויטרופילים בבריאות ובחוליים שלנו.
Introduction
סחר נויטרופילים משחק תפקיד קריטי בקביעת ההתקדמות והרזולוציה של רבים מצבים דלקתיים, כוללים טרשת עורקים 1, זיהום חיידקים או אלח דם 2, ולשרוף פציעה 3. על התרומה הגדולה שלהם למצבים בריאותיים ומחלות, ספירת נויטרופילים היא חלק מבדיקות הדם הסטנדרטי נחשבות לעתים קרובות במעבדות קליניות ומחקר. עם זאת, למרות היותו אחד המבחנים הנפוצים ביותר, את הערך של ספירת נויטרופילים באבחנה של זיהום ואלח דם נחקר בתדירות גבוהה 4. לדוגמא, מחקר אחד של נויטרופילים בחולי כווייה גילה כי ספירת נויטרופילים ותפקוד הגירת נויטרופילים לא לתאם; המסמנים נויטרופילים כי לספור לבדו אינו אינדיקציה מדויקת של מצב חיסוניים 3. אמנם קשה יותר למדידה, יכולת התפקודית נויטרופילים הוצעה כבעל ערך רב יותר במגוון רחב של תנאים.
t "> חשוב לציין, שרבים מפגמי נויטרופילים הם ארעיים ואינם מופעלים על ידי פגמים גנטיים קבועים, הבחנה שהתעלמה במידה רבה במרפאת עד לאחרונה. בהקשר של פציעות לשרוף, הגירת נויטרופילים יכולה להיות במעקב במהלך הטיפול של חולה כמדד למצב דלקתי או זיהום 3. מבחני הגירה מסורתיים המשמשים כיום במעבדה (קאמרי בוידן, קאמרי דאן, assay micropipette) לא יכול להיות מתורגם להגדרה קלינית כי הם דורשים כמויות גדולות של דם ומסורבל זמן רב טכניקות בידוד נויטרופילים (טבלה 1). מבחני אלה גם לא יכולים להשתמש בהם כדי לעקוב אחר שינויים חולפים בchemotaxis נויטרופילים בחיות מעבדה קטנות, כגון עכברים, כי נפח דם הדרוש לבידוד נויטרופילים מאפשר רק דגימה אחת, ולעתים קרובות אפילו דורש איגום דם מחיות מרובות עבור assay אחד. למשל, מ 'מחקר מעורבתנאי ultiple וטיפולים לאורך זמן, מספר רב של נקודות עלולים לדרוש אלפי עכברים באמצעות מבחני chemotaxis הנוכחיים. זה מגביל את המחקר הביולוגי הבסיסי שניתן לעשות כדי להבין את הדינמיקה המורכבת של תפקוד מערכת החיסון בהקשר של פציעה, זיהום או לצרוב לעתים קרובות למדו במודלים העכבריים 5.כדי לענות על הצורך לassay הפונקציונלי נויטרופילים כי הוא מהיר, חזק, תוך דרישה מינימאלי נפח דם, שפיתחנו מכשיר microfluidic המודד chemotaxis נויטרופילים ישירות מטיפה קטנה של דם מלא. זה ידוע כי גורמים רבים בדם כולו, כוללים בסרום 6 וטסיות דם 7, להשפיע על תפקוד נויטרופילים. לכן זה מועיל שכל assay microfluidic הדם ממזער עיבוד מדגם לשמור microenvironment vivo של נויטרופילים כאשר מודד שינויים בchemotaxis עם assay במבחנה 8. גישה זומפחית את הזמן מאיסוף דם למבחני הגירת נויטרופילים משעות תוך שימוש בטכניקות מסורתיות, לדקות ספורות (טבלה 1). פלטפורמת microfluidic הדם כולו מייצרת שיפוע chemoattractant יניארי יציב לאורכו של הניסוי, אין לו חלקים נעים, ואינה דורשת מקור לחץ חיצוני (משאבת מזרק כלומר). תכונת מפתח בעיצוב של מכשיר microfluidic הדם השלם היא שילוב של תאי דם אדומים מסרק סינון (RBC) כי מכאני מסנני RBCs מלהיכנס לערוץ ההגירה של המכשיר. הפניות ימינה של מסרק סינון זה למנוע את הצורך בסינון הרחקת גודל, שעשוי להיות סתום על ידי תאי דם אדומים ולכן לחסום את שיפוע chemoattractant מלהגיע נויטרופילים פעיל הנודדים בWB. השילוב של מכשיר microfluidic הדם כולו בצלחת 12 או 24 גם מאפשר ההקרנה של מתווכים מרובים של si chemotaxis נויטרופילים אדם או העכבריmultaneously.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו, שפיתחנו פלטפורמת microfluidic למדוד chemotaxis נויטרופילים מטיפה של דם (2 μl). הסינון המכני על השבב של תאי דם אדום מפעיל נודדים נויטרופילים עוקף את הצורך בשיטות מסורבלות הפרדת תא כגון צפיפות הדרגתיים 10, סלקציה חיובית 11, או סלקציה שלילית 12, אשר נוטות לה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תמיכה מן המכונים הלאומיים לבריאות (מעניקה GM092804, DE019938) ושריינרים ברנס בבית חולים.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
