微流体平台从未经加工的全血测定中性粒细胞趋
Summary
这个协议的细节设计，从全血具有强大的可重复性一滴测量人体中性粒细胞的趋化作用的试验。这种方法绕过了必要的中性粒细胞的分离和需要测定的准备时间仅几分钟。微流控芯片使中性粒细胞的趋化作用的重复测量随着时间的推移在婴儿或小型哺乳动物，其中样品体积是有限的。
Abstract
中性粒细胞在抵御感染和它们的数量在血液中发挥至关重要的作用，经常测量在诊所。在血液中较高的中性粒细胞计数通常持续感染的指标，而低中性粒细胞计数是一个警告标志的感染风险较高。为了实现其职能，中性粒细胞也必须能够有效地从那里度过大部分生命的血液移动，进入组织，在感染发生。因此，在嗜中性粒细胞的迁移能力的任何缺陷可以提高风险的感染，即使在中性粒细胞是存在于血液中的相应的数字。但是，衡量在诊所中性粒细胞迁移能力是一项艰巨的任务，这是费时，需要大量的血液，和专家知识。为了解决这些限制，我们设计了一个强大的微流体检测中性粒细胞的迁移，这需要未处理血单个液滴，circum气孔的必要性嗜中性粒细胞分离，并且容易量化的简单的显微镜。在该测定中，嗜中性粒细胞直接从血液滴，迁移通过小通道朝趋化因子的来源。为了防止通过同一信道的红血细胞的颗粒流，我们实现了机械过滤器具有直角转弯，其选择性地阻挡红细胞的前进。我们通过从手指刺和静脉血采集的血液滴比较中性粒细胞迁移的验证实验。我们还比较了这些全血（WB）的来源与中性粒细胞纯化样品中性粒细胞迁移，发现三个来源之间保持一致的速度和方向。此微流体平台将使人类中性粒细胞迁移的研究在临床和研究环境，以帮助增进我们的健康和疾病中性粒细胞功能的理解。
Introduction
嗜中性粒细胞贩卖起着决定的许多炎症性疾病，包括动脉粥样硬化1，细菌感染或败血症2的进度和分辨率的关键作用，以及烧伤3。对于健康和疾病状况做出的巨大贡献，中性粒细胞计数的标准血液分析通常被认为在临床和科研实验室的一部分。然而，尽管是一种最普遍的测试，中性粒细胞计数在感染和败血症的诊断价值已频频质疑4。例如，在烧伤病人的中性粒细胞的一项研究发现，嗜中性粒细胞计数和中性粒细胞迁移的功能不相关;标志着单独的中性粒细胞计数是不是免疫状态3的准确指标。虽然越来越多的难以衡量，中性粒细胞功能的能力提出了更有价值的各种条件。
T“>重要的是，许多嗜中性粒细胞缺陷是短暂的，不会被永久的遗传缺陷，已经在很大程度上忽略了诊所，直到最近的区分触发。在烧伤的情况下，中性粒细胞迁移能的过程中被监控病人的治疗，炎症状态或感染3的指标。目前在实验室（Boyden小室，邓恩室，微量法）使用传统迁移实验不能转换成临床上，因为它们需要大量的血液和繁琐费时嗜中性粒细胞分离技术（ 表1）。这些测定也不能用来监测在小的实验室动物，如小鼠的嗜中性粒细胞趋化性的瞬时变化，由于血液所需的嗜中性粒细胞隔离的体积只允许有一个样品甚至常常需要汇集血液从多个动物为一个单一的测定，例如，涉及的研究米在多个时间点ultiple条件和治疗方法可以使用目前的趋化实验可能需要上千小鼠。这限制了基础生物学研究是可以做到的，了解的损伤，感染的情况下免疫功能的复杂动态或烧伤经常研究在小鼠模型5。以满足对嗜中性粒细胞功能测定法是快速，健壮，同时要求最小的血液量，我们已经开发了直接从一个小液滴的全血测定中性粒细胞趋化性的微流体装置。它是已知的许多因素中的全血，血清，包括6和血小板7，影响嗜中性粒细胞的功能。因此，它是有益的，该全血的微流体测定最大限度地减少样品处理测量的变化趋当与体外测定8维持体内微环境中的中性粒细胞。这种方法降低时间从采血到使用传统技术时中性粒细胞迁移实验，以短短几分钟内（ 表1）。全血的微流体平台产生用于实验的长度的稳定的线性趋化梯度，没有移动部件，并且不需要外部压力源（ 例如注射器泵）。在全血中的微流体设备的设计中的关键特征是红细胞（RBC）的过滤梳机械地过滤进入设备的迁移通道的RBCs的掺入。这个过滤梳的右转弯防止需要排阻过滤，这将可能由红细胞堵塞，因此到达在WB的积极迁移阻断中性粒细胞趋化梯度。全血的微流体装置的一个12或24孔板的掺入促进人或鼠中性粒细胞趋化性的Si多种介质的筛分multaneously。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这项工作中，我们开发了一个微流体平台，从血液滴（2微升）测量嗜中性粒细胞的趋化性。红细胞从积极的中性粒细胞迁移的芯片上的机械过滤规避了繁琐的细胞分离方法如密度梯度10，正选择11或阴性选择12，这很容易通过激活嗜中性粒细胞引入伪像。红细胞的机械过滤区分我们的技术与其他微流控芯片，用于探测中性粒细胞迁移。例如，从本实验室13和以往?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
来自美国国立卫生研究院支持（授予GM092804，DE019938）和烧伤的Shriners医院。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
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