Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé
Summary
Ce protocole détaille un test destiné à mesurer la chimiotaxie des neutrophiles humaine d'une gouttelette de sang total avec une reproductibilité robuste. Cette approche évite la nécessité d'une séparation des neutrophiles et ne nécessite que quelques minutes de test de temps de préparation. La puce microfluidique permet la mesure répétée de la chimiotaxie des neutrophiles au fil du temps chez les nourrissons ou les petits mammifères, où le volume de l'échantillon est limité.
Abstract
Les neutrophiles jouent un rôle essentiel dans la protection contre les infections et leur nombre dans le sang sont souvent mesurés à la clinique. Le nombre de neutrophiles plus élevés dans le sang sont généralement un indicateur des infections en cours, tandis que faible numération des neutrophiles sont un signe d'alerte pour des risques plus élevés pour les infections. Pour accomplir leurs fonctions, les neutrophiles doivent également être en mesure de se déplacer efficacement dans le sang où ils passent la plupart de leur vie, dans les tissus, où les infections se produisent. Par conséquent, tous les défauts de la capacité des neutrophiles de migrer peuvent augmenter les risques d'infections, même lorsque les neutrophiles sont présents en nombre suffisant dans le sang. Toutefois, la mesure de la capacité de migration des neutrophiles dans la clinique est une tâche difficile, qui prend du temps, nécessite volume important de sang, et les connaissances d'experts. Pour répondre à ces limitations, nous avons conçu un solide tests microfluidiques pour la migration des neutrophiles, qui nécessite une seule goutte de sang non traité, circumévents la nécessité d'une séparation des neutrophiles, et est facile à quantifier sur un simple microscope. Dans ce dosage, les neutrophiles migrent directement à partir de la goutte de sang, à travers de petits canaux, vers la source de chimio-attractif. Pour éviter que le flux granulaire de globules rouges par la même voie, nous avons mis filtres mécaniques avec des virages à angle droit qui bloquent sélectivement l'avance de globules rouges. Nous avons validé le test en comparant la migration des neutrophiles de gouttelettes de sang prélevés de piqûre au doigt et le sang veineux. Nous avons également comparé les sang total (WB) sources de la migration des neutrophiles à partir d'échantillons de neutrophiles purifiés et trouvé une vitesse constante et la directionnalité entre les trois sources. Cette plate-forme microfluidique permettra l'étude de la migration des neutrophiles humain dans la clinique et le contexte de la recherche pour faire avancer notre compréhension des fonctions des neutrophiles dans la santé et la maladie.
Introduction
trafic de neutrophiles joue un rôle déterminant dans l'évolution et la résolution de nombreuses affections inflammatoires, y compris l'athérosclérose 1, infection bactérienne ou une septicémie 2, et 3 de brûlures. Pour leur importante contribution à des conditions de santé et de maladie, le nombre de neutrophiles est partie de l'analyse de sang norme souvent considéré dans les laboratoires cliniques et de recherche. Toutefois, en dépit d'être l'un des tests les plus répandus, la valeur de la numération des neutrophiles dans le diagnostic de l'infection et de septicémie a été souvent interrogé 4. Par exemple, une étude de neutrophiles chez les patients atteints de brûlures a révélé que le nombre de neutrophiles et la fonction de la migration des neutrophiles ne concordent pas; ce qui signifie que nombre de neutrophiles seul n'est pas un indicateur précis de l'état immunitaire 3. Bien que plus difficile à mesurer, la compétence fonctionnelle des neutrophiles a été proposée comme plus précieuse dans un large éventail de conditions.
t "> Surtout, la plupart des défauts de neutrophiles sont transitoires et ne sont pas déclenché par des anomalies génétiques permanents, une distinction qui a été largement négligé dans la clinique jusqu'à récemment. Dans le cadre de brûlure, la migration des neutrophiles pourrait être surveillée au cours de le traitement d'un patient comme un indicateur de l'état inflammatoire ou une infection 3. tests traditionnels de migration actuellement utilisés dans le laboratoire (chambre de Boyden, chambre Dunn, micropipette essai) ne peut pas être traduite dans un cadre clinique, car ils nécessitent de grandes quantités de sang et encombrant temps Des techniques d'isolation des neutrophiles (tableau 1). Ces dosages peuvent également pas être utilisés pour surveiller des changements transitoires de la chimiotaxie des neutrophiles chez les petits animaux de laboratoire, tels que les souris, parce que le volume de sang nécessaire pour l'isolement des neutrophiles permet un seul échantillon, et souvent même exige la mise en commun d' le sang de plusieurs animaux pour un seul essai. Par exemple, une étude portant sur mconditions ultiple et des traitements sur plusieurs points dans le temps pourraient exiger des milliers de souris en utilisant des tests de chimiotactisme actuelles. Cela limite la recherche biologique de base qui peut être fait pour comprendre la dynamique complexe de la fonction immunitaire dans le cadre de blessure, une infection ou brûler souvent étudiée dans les modèles murins 5.Pour répondre à la nécessité d'un dosage fonctionnel des neutrophiles qui est rapide et robuste, tout en nécessitant un minimum de volume de sang, nous avons développé un dispositif microfluidique qui mesure directement la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une petite gouttelette de sang total. Il est connu que de nombreux facteurs dans le sang total, le sérum, y compris les plaquettes 6 et 7, affectent la fonction des neutrophiles. Il est donc avantageux que l'ensemble de dosage microfluidique de sang réduit au minimum le traitement des échantillons pour maintenir le micro-environnement in vivo de la neutrophiles lors de la mesure des variations de la chimiotaxie avec un essai in vitro 8. Cette approcheréduit le temps de collecte de sang pour des tests de migration des neutrophiles provenant heures en utilisant des techniques classiques, à quelques minutes (tableau 1). L'ensemble de la plate-forme de micro-fluidique de sang produit un gradient chimiotactique linéaire stable pour la durée de l'expérience, n'a pas de parties mobiles, et ne nécessite pas une source de pression externe (par exemple de la pompe à seringue). La caractéristique clé de la conception de l'ensemble du dispositif de microfluidique sanguin est l'incorporation d'un globule rouge (RBC) de peigne de filtration qui filtre mécaniquement les globules rouges de pénétrer dans le canal de migration du dispositif. Les virages à droite de ce peigne de filtration empêchent la nécessité pour la filtration d'exclusion de taille, qui serait susceptible d'être bouché par les globules rouges et donc bloquent le gradient chimiotactique d'atteindre les neutrophiles migrent activement à la Banque mondiale. L'incorporation de l'ensemble du dispositif de microfluidique de sang dans une plaque à 12 ou 24 puits facilite le criblage de multiples médiateurs de la chimiotaxie des neutrophiles si humaine ou murinemultanément.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous avons développé une plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles à partir d'une goutte de sang (2 pi). La filtration sur puce mécanique des globules rouges à partir de la migration des neutrophiles activement contourne le besoin de méthodes lourdes de séparation de cellules telles que les gradients de densité 10, 11 sélection positive, la sélection négative ou 12, qui sont susceptibles d'introduire des artefacts en activant les neu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien des National Institutes of Health (accorde GM092804, DE019938) et de l'Hôpital Shriners Burns.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
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