Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut
Summary
Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.
Abstract
Neutrophile Granulozyten spielen eine wesentliche Rolle beim Schutz gegen Infektionen und ihre Zahl im Blut sind häufig in der Klinik gemessen. Höhere Anzahl von neutrophilen Granulozyten im Blut sind in der Regel ein Indikator für die laufende Infektionen, während niedrige neutrophilen Granulozyten sind ein Warnzeichen für höhere Risiken für Infektionen. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, haben Neutrophilen auch in der Lage, effektiv aus dem Blut, wo sie die meisten ihr Leben damit verbringen zu bewegen, in die Gewebe, in denen Infektionen auftreten. Folglich können Mängel in der Fähigkeit von Neutrophilen zu migrieren, die Risiken für Infektionen erhöhen, auch wenn Neutrophilen im entsprechenden Zahlen im Blut vorhanden sind. , Mess-Migration von Neutrophilen Fähigkeit in der Klinik ist jedoch eine anspruchsvolle Aufgabe, die zeitaufwendig ist, erfordert große Mengen an Blut, und Fachwissen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, haben wir eine robuste mikrofluidischen Assays für die Migration von Neutrophilen, die einen einzigen Tropfen Blut benötigt unverarbeitete, Umständeentlüftet die Notwendigkeit Neutrophilen Trennung und ist leicht auf einem einfachen Mikroskop quantifiziert. In diesem Assay wandern Neutrophile direkt von den Blutstropfen durch kleine Kanäle in Richtung der Quelle des chemoattraktiven. Um die körnige Strömung der roten Blutkörperchen durch die gleichen Kanäle zu verhindern, setzten wir mechanische Filter mit Winkelstellt, dass selektiv den Vormarsch der roten Blutzellen zu blockieren. Wir validiert den Assay durch den Vergleich die Migration von Neutrophilen aus Bluttropfen aus dem Finger stechen und venösen Blut gesammelt. Wir verglichen auch diese Vollblut (WB) Quellen mit Migration von Neutrophilen aus Proben von gereinigten Neutrophilen und gefunden konstante Geschwindigkeit und Richtungs zwischen den drei Quellen. Das mikrofluidische Plattform wird die Untersuchung der menschlichen Migration von Neutrophilen in der Klinik und der Forschung Einstellung aktivieren, um unser Verständnis der Neutrophilen-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.
Introduction
Neutrophile Handel spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Fortschritts und der Auflösung von vielen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose 1, bakterielle Infektion oder Sepsis 2, 3 und Verletzungen zu verbrennen. Für ihren wichtigen Beitrag zur Gesundheit und Krankheit Bedingungen ist Neutrophilenzahl Teil der Standard-Blutanalyse oft in der klinischen und Forschungslabors berücksichtigt. Doch obwohl sie eine der am weitesten verbreiteten Tests, der Wert der Neutrophilen in der Diagnostik von Infektionen und Sepsis ist häufig in Frage 4 wurde. Zum Beispiel, eine Studie von Neutrophilen bei Verbrennungspatienten ergab, dass Neutrophilen und die Migration von Neutrophilen-Funktion nicht korrelieren; was bedeutet, dass allein der neutrophilen Granulozyten ist nicht eine genaue Anzeige des Immunstatus 3. Obwohl schwieriger zu messen, hat Neutrophilen funktionale Kompetenz als wertvoller in einem breiten Bereich von Bedingungen vorgeschlagen worden.
t "> Wichtig ist, dass viele der Neutrophilen-Defekte sind flüchtig und werden durch permanente genetische Defekte, eine Unterscheidung, die weitgehend in der Klinik übersehen wurde bis vor kurzem ausgelöst. Im Rahmen der Brandverletzungen, könnte die Migration von Neutrophilen im Verlauf überwacht werden Behandlung eines Patienten als Indikator der Entzündungszustand oder Infektions 3. Die Migrationsassays gegenwärtig im Labor (Boyden-Kammer, Dunn Kammer Mikroassay) verwendet wird, kann nicht in einer klinischen Umgebung umgesetzt werden, da sie große Mengen an Blut und umständlich zeitraub Neutrophilen-Isolationstechniken (Tabelle 1). Diese Tests können auch nicht verwendet werden, um vorübergehende Veränderungen in Neutrophilen-Chemotaxis in kleinen Labortieren wie Mäusen zu überwachen, da die Lautstärke von Blut für neutrophile Isolierung erforderlich ermöglicht nur eine Probe und oft sogar erfordert die Bündelung von Blut von verschiedenen Tieren für einen einzelnen Assays. Zum Beispiel eine Studie mit mehrere Bedingungen und Behandlungen über mehrere Zeitpunkte erfordern möglicherweise Tausende von Mäusen mit aktuellen Chemotaxis-Assays. Dies schränkt die biologische Grundlagenforschung, die getan werden, um die komplexe Dynamik der Immunfunktion im Zusammenhang mit Verletzungen, Infektionen oder verstehen oft brennen in den Mausmodellen 5 untersucht werden.Um die Notwendigkeit für einen Neutrophilen-Funktionsassay, das eine schnelle, robust ist, während bei minimaler Blutvolumen zu lösen, haben wir eine Mikrofluidvorrichtung, die Neutrophilen-Chemotaxis von einer kleinen Tröpfchen von Blut misst direkt entwickelt. Es ist bekannt, daß viele Faktoren in Vollblut, Serum, einschließlich Plättchen 6 und 7 betreffen Neutrophilen-Funktion. Es ist daher vorteilhaft, dass das Vollblut mikrofluidischen Tests minimiert Probenverarbeitung, um die in vivo-Mikroumgebung der Neutrophilen zu halten, wenn die Messung Unterschiede in Chemotaxis mit einem de vitro-Assay-8. Dieser Ansatzreduziert die Zeit von der Blutentnahme bis die Migration von Neutrophilen-Assays von Stunden mit traditionellen Techniken, um nur Minuten (Tabelle 1). Das Vollblut mikrofluidischen Plattform eine stabile lineare chemoattractant Gradienten für die Dauer des Experiments, hat keine beweglichen Teile und keine externe Druckquelle (z. B. eine Spritzenpumpe) erforderlich. Das Schlüsselmerkmal bei der Gestaltung des Gesamtblut mikrofluidischen Vorrichtung ist der Einbau von roten Blutkörperchen (RBC), die mechanisch Filtration Kammfilter von RBCs in die Migration Kanal des Gerätes. Die Rechtskurven dieser Filterkamm verhindern, dass die Notwendigkeit für Größenausschluss-Filtration, die wahrscheinlich von RBC verstopft sein würde und deshalb blockieren die chemoattractant Gradienten vom Erreichen der Migration von Neutrophilen aktiv in der WB. Der Einbau des Vollbluts in einer Mikrofluidik-Vorrichtung 12 oder 24-Well-Platte erleichtert das Screening mehrerer Mediatoren der humanen oder murinen Neutrophilenchemotaxis sizeitig.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Arbeit entwickelten wir eine mikrofluidische Plattform Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Blut (2 ul) zu messen. Der On-Chip-mechanische Filtration von Erythrozyten aus aktiv Migration Neutrophilen umgeht die Notwendigkeit umständlicher Zelltrennverfahren, wie Dichte-Gradienten 10, 11 positive Selektion, negative Selektion oder 12, die anfällig für Artefakte, die durch Neutrophile aktivierenden einzuführen. Die mechanische Filtration von Erythrozyten unterscheidet unsere Techno…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung von den National Institutes of Health (GM092804 gewährt, DE019938) und Verbrennungen Shriners Hospital.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
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