Микрофлюидных Платформа для измерения хемотаксис нейтрофилов из необработанного цельной крови
Summary
Этот протокол детали по результатам анализа предназначен для измерения человеческого хемотаксис нейтрофилов из одной капли цельной крови с надежной воспроизводимости. Такой подход позволяет обойти необходимость разделения нейтрофилов и требует всего несколько минут для анализа времени на подготовку. Микрожидкостных чип позволяет повторное меру хемотаксис нейтрофилов в течение долгого времени у младенцев или мелких млекопитающих, где объем образца ограничено.
Abstract
Нейтрофилы играют существенную роль в защите от инфекций и их номера в крови часто измеряется в клинике. Более высокие нейтрофилов в крови, как правило, является показателем текущих инфекций, в то время как низкие показатели нейтрофилов являются предупреждающий знак для более высоких рисков для инфекций. Для выполнения своих функций, нейтрофилы также должны быть в состоянии эффективно перейти от крови, где они проводят большую часть своей жизни, в ткани, где происходят инфекции. Следовательно, любые дефекты в способности нейтрофилов мигрировать может увеличить риск для инфекций, даже когда нейтрофилы присутствуют в соответствующих количествах в крови. Тем не менее, измерения миграции нейтрофилов способности в клинике является сложной задачей, которая требует много времени, требуется большой объем крови, и экспертные знания. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали надежные микрофлюидных анализов для миграции нейтрофилов, которая требует единого капельку необработанной крови, обстоятельствоотверстия необходимость разделения нейтрофилов и легко количественно на простом микроскопом. В этом анализе нейтрофилы мигрируют непосредственно от капли крови, через небольшие каналы, по направлению к источнику хемоаттрактанта. Для предотвращения гранулированный поток эритроцитов по тем же каналам, мы внедрили механические фильтры с прямым углом поворачивает, что выборочно блокировать продвижение красных кровяных клеток. Мы подтвердили анализа путем сравнения миграцию нейтрофилов из капель крови, собранных от пальца, и венозной крови. Мы также сравнили эти цельной крови (ВБ) источников с миграцию нейтрофилов из образцов очищенных нейтрофилов и нашел постоянную скорость и направленность между тремя источниками. Это микрофлюидных платформа позволит изучение миграции нейтрофилов человека в клинике и установке исследования, чтобы помочь продвинуть наше понимание нейтрофилов функций в норме и патологии.
Introduction
Торговля нейтрофилов играет важную роль в определении прогресса и решение многих воспалительных заболеваний, в том числе атеросклероза 1, бактериальной инфекции или сепсиса 2 и ожогов 3. Для их большой вклад в здоровье и болезни условиях, количество нейтрофилов является частью стандартного анализа крови часто считается в клинических и научно-исследовательских лабораторий. Тем не менее, несмотря на то, один из самых распространенных испытаний, значение количества нейтрофилов в диагностике инфекции и сепсиса неоднократно сомнение 4. Например, одно исследование нейтрофилов в ожоговых больных показали, что число нейтрофилов и число нейтрофилов функция миграции не коррелируют; означающее рассчитывать уже о том нейтрофилов не является точным показателем иммунного статуса 3. Хотя более трудно измерить, нейтрофилов функциональные компетенции был предложен в качестве более ценными в широком диапазоне условий.
т "> Важно отметить, что многие из нейтрофилов дефектов являются временными и не вызывают постоянных генетических дефектов, различие, которое не в значительной степени игнорируется в клинике до недавнего времени. В контексте ожогов, миграцию нейтрофилов может контролироваться в ходе Лечение пациента в качестве индикатора воспалительного статуса или инфекции 3. Традиционные анализы миграции в настоящее время используются в лаборатории (Бойден камера, Данн камера, микропипетка анализа) не могут быть переведены в клинических условиях, так как они требуют больших объемов крови и громоздким времени методы изоляции нейтрофилов (табл. 1). Эти анализы также не может быть использован для мониторинга переходных изменений в хемотаксис нейтрофилов в мелких лабораторных животных, таких как мыши, так как объем крови, необходимый для выделения нейтрофилов позволяет только один образец, а часто и требуется объединение кровь из нескольких животных для одного анализа. Например, исследование с участием мultiple условия и процедуры на нескольких временных точках потенциально может потребовать тысячи мышей с использованием текущих хемотаксиса. Это ограничивает основную биологические исследования, что можно сделать, чтобы понять сложную динамику иммунной функции в контексте травмы, инфекции или записать часто изучаются в мышиных моделях 5.Чтобы удовлетворить потребность в нейтрофилов функциональном анализе, что является быстрым, надежным, но требует минимальный объем крови, мы разработали микрофлюидных устройство, которое измеряет хемотаксис нейтрофилов непосредственно из небольшого капли цельной крови. Известно, что многие факторы в цельной крови, в том числе сыворотки 6 и 7 тромбоцитов, влияет на функцию нейтрофилов. Поэтому выгодно, что весь Микрожидкостных кровь для анализа минимизирует пример обработки для поддержания микросреду в естественных условиях нейтрофилов при измерении изменения в хемотаксиса с помощью анализа ин витро 8. Этот подходсокращает время от сбора крови для миграции нейтрофилов анализов от часов, используя традиционные методы, чтобы всего за несколько минут (табл. 1). Весь микрофлюидных крови платформа дает устойчивую линейную хемоаттрактантных градиент для длины эксперимента, не имеет движущихся частей, и не требует внешнего источника давления (т.е. шприц насоса). Ключевой особенностью в дизайне всей микрофлюидных крови устройства является включение эритроцита (РБК) фильтрации гребень, что механически фильтрует эритроциты от входа в миграционную канал устройства. Правые повороты этой фильтрации гребень предотвратить необходимость фильтрации гель, который, вероятно, будет забит эритроцитов и, следовательно, блокировать хемоаттрактантных градиент от достижения активно мигрирующих нейтрофилов в ВБ. Включение всей микрофлюидный крови устройства в 12 или в 24-луночный планшет облегчает скрининг нескольких медиаторов человека или мышиного хемотаксиса нейтрофилов сименно.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе, мы разработали микрофлюидных платформу для измерения хемотаксис нейтрофилов от капли крови (2 мкл). Механическая фильтрация на-чипе эритроцитов из активно мигрируют нейтрофилы обходит необходимость в громоздких методов разделения клеток, таких как градиенты плотности <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка от Национальных Институтов Здоровья (предоставляет GM092804, DE019938) и Shriners Burns больницы.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
References
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
