뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em> 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는> 접근
Summary
신경 세포막 매매 동적 세포막 단백질 가능 크게 영향 신경 전달을 제어한다. 지금까지, 그것은 성인의 신경 세포에서 신경 세포 내 이입 매매를 측정하기 위해 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 발현 생체의 급격한 변화를 측정 할 수있는 매우 효과적인, 양적 방법을 설명합니다.
Abstract
레귤 이입 매매 동적 분의 시간 스케일에서 수용체, 이온 채널 및 전달체 세포 표면 프레젠테이션을 제어함으로써, neuromodulatory 다양한 이벤트를 용이 중앙 메커니즘이다. 개별 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어 메커니즘의 폭 넓은 다양성이있다. 인신 분자 토대를 조사 연구는 주로 정량적 외인성 자극 및 유전자 조작에 응답하여 세포막 단백질의 표면 발현의 변화를 측정하는 표면 바이오 티 닐화에 의존했다. 그러나,이 방법은 주로 충실히 성숙한 신경 세포 재생에 중요한 생리 학적 기전을 반영하지 않을 수도 배양 된 세포로 국한되었다. 또한, 배양 세포의 접근은 인신 매매 메커니즘의 지역별 차이를 과소 평가 할 수 있습니다. 여기, 우리는 급성 뇌 조각 준비에 세포 표면의 바이오 티 닐화를 확장하는 방법을 설명합니다. 우리이 방법은 성숙한 신경 세포에서 세포막 단백질 표면 수준의 급격한 변화를 측정하는 고 충실도 접근법을 제공한다는 것을 보여준다. 이 방법은 신경 세포 내 이입 매매의 분야에서 광범위한 유틸리티를 가질 가능성이있다.
Introduction
세포 내 이입 매매는 필수적인 막 단백질의 다양한 세포막의 프레 젠 테이션을 미세 조정 유비쿼터스 세포 메커니즘입니다. 엔도 시토 시스는 세포 내 환경 1에 필수 영양소를 제공하며, 수용체 활성화 2에 대한 응답으로 수용체 신호 둔감해진다. 확대 원형질막에 리사이클 이입은 별도로 세포 표면 (3)에 단백질 발현 수준을 증가시킴으로써 세포 신호 전달을 향상시킬 수있다. 또한, 멤브레인 인신 매매의 교란은 단백질의 세포 내 이입 매매를 제어하는 분자 메커니즘을 조사 할 필요성을 강조, 수많은 질병과 병적 인 조건 4,5에 연루되어있다. 많은 단백질이 지난 몇 년 동안 증거를 장착 고전 방 clathrin 의존 국제화 메커니즘을 사용하는 동안 여러 방 clathrin 독립적 인 세포 내 이입 메커니즘의 증가 배열의 세포 내 이입 가능성을 제어 것을 보여줍니다단백질 6,7. 따라서, 생리 관련 시스템에서 인신 매매를 촉진하는 세포 내 이입 메커니즘을 조사 할 필요가 상당히 성장했습니다.
뇌의 수용체, 이온 채널과 신경 전달 물질 수송의 세포 내 이입 매매는 시냅스 가소성 8-11 궁극적으로 신경 세포의 흥분성 시냅스 반응에 영향을 남용 12-15의 약물에 반응을 수립 기본 역할을하고 있습니다. 신경 세포의 인신 매매의 대부분의 연구는 이종 발현 시스템 또는 양식 기본 뉴런 하나에 의존하는 현재까지, 어느 것도 확실하게 성인 신경 세포 재생의 메커니즘을 반영 할 수있다. 여기, 우리는 양적으로 성인 설치류에서 파생 된 급성 뇌 조각의 표면 단백질의 수준을 측정하는 표면의 바이오 티 닐화를 사용하는 방법을보고합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 마우스 선조체 도파민 수송 체에 재 빠르게 내부화 입증 자료를 제시포르 볼 에스테르 – 매개 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화에 sponse.
Protocol
Representative Results
Discussion
두뇌에 매우 영향 시냅스 신호 이입 매매, 그것은 양적으로 성인 신경 세포의 표면 단백질 발현의 변화를 측정하기 어려운 입증했다고 오랜 지식에도 불구하고. 이 작품에서 우리는 급성 뇌 조각의 표면 단백질 생체 레이블을 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을보고합니다. 그들은 시냅스 연결과 자신의 준비 시간 이후에 세포 생존을 위로 유지로 뇌 조각의 준비는, 전기 생리학 레코딩을위한…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 HEM에 NIH 교부금 DA15169 및 DA035224에 의해 투자되었다
Materials
| sulfo NHS-SS-biotin | Pierce | 21331 | |
| Streptavidin agarose | Pierce | 20347 | |
| IgG-free, Protease-free Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | |
| Vibrating microtome sectioner | Various | ||
| Shaking water bath | various | ||
| Milli-cell mesh-bottomed inserts (8µm pore size) | Millipore | PI8P 012 50 | These can be washed by hand and re-used |
References
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Zastrow, M., Williams, J. T. Modulating neuromodulation by receptor membrane traffic in the endocytic pathway. Neuron. 76, 22-32 (2012).
- Leto, D., Saltiel, A. R. Regulation of glucose transport by insulin: traffic control of GLUT4. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13, 383-396 (2012).
- Liu, Y. W., Lukiyanchuk, V., Schmid, S. L. Common membrane trafficking defects of disease-associated dynamin 2 mutations. Traffic. 12, 1620-1633 (2011).
- Li, X., DiFiglia, M. The recycling endosome and its role in neurological disorders. Prog. Neurobiol. , 127-141 (2012).
- Sandvig, K., Pust, S., Skotland, T., van Deurs, B. Clathrin-independent endocytosis: mechanisms and function. Curr. Opin. Cell Biol. 23, 413-420 (2011).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Res. 20, 256-275 (2010).
- Barry, M. F., Ziff, E. B. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 279-286 (2002).
- Bredt, D. S., Nicoll, R. A. AMPA receptor trafficking at excitatory synapses. Neuron. 40, 361-379 (2003).
- Kerchner, G. A., Nicoll, R. A. Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP. Nat. Rev. Neurosci. 9, 813-825 (2008).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
- Borgland, S. L., Malenka, R. C., Bonci, A. Acute and chronic cocaine-induced potentiation of synaptic strength in the ventral tegmental area: electrophysiological and behavioral correlates in individual rats. J. Neurosci. 24, 7482-7490 (2004).
- Dong, Y., et al. Cocaine-induced potentiation of synaptic strength in dopamine neurons: Behavioral correlates in GluRA(-/-) mice. PNAS. 101, 14282-14287 (2004).
- Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory. Annu. Rev. Neurosci. 29, 565-598 (2006).
- Thomas, M. J., Malenka, R. C. Synaptic plasticity in the mesolimbic dopamine system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358, 815-819 (2003).
- Sorkina, T., Hoover, B. R., Zahniser, N. R., Sorkin, A. Constitutive and protein kinase C-induced internalization of the dopamine transporter is mediated by a clathrin-dependent mechanism. Traffic. 6, 157-170 (2005).
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical, distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat. Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J. Biol. Chem. 278, 22168-22174 (2003).
- Melikian, H. E., Buckley, K. M. Membrane trafficking regulates the activity of the human dopamine transporter. J. Neurosci. 19, 7699-7710 (1999).
- Daniels, G. M., Amara, S. G. Regulated trafficking of the human dopamine transporter. Clathrin-mediated internalization and lysosomal degradation in response to phorbol esters. J. Biol. Chem. 274, 35794-35801 (1999).
- Sorkina, T., et al. RNA interference screen reveals an essential role of Nedd4-2 in dopamine transporter ubiquitination and endocytosis. J. Neurosci. 26, 8195-8205 (2006).
- Eriksen, J., et al. Visualization of dopamine transporter trafficking in live neurons by use of fluorescent cocaine analogs. J. Neurosci. 29, 6794-6808 (2009).
- Rao, A., Simmons, D., Sorkin, A. Differential subcellular distribution of endosomal compartments and the dopamine transporter in dopaminergic neurons. Mol. Cell Neurosci. 46, 148-158 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8, 745-752 (2011).
