Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Summary

El continuo crecimiento de los incisivos ratón proporciona un modelo para el estudio de la renovación de los tejidos dentales a partir de células madre epiteliales dentales (DESCs). Un sistema sólido para la obtención de manera consistente y confiable de estas células de la incisivo y expandir in vitro se informó aquí.

Abstract

La comprensión de los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la regeneración de dientes y la renovación se ha convertido en un tema de gran interés ^1-4, y el incisivo ratón proporciona un modelo para estos procesos. Este órgano notable crece continuamente durante toda la vida del animal y genera todos los tipos de células necesarios de piscinas activas de las células madre adultas alojados en el labial (hacia el labio) y lingual (hacia la lengua) (CL) regiones cervical bucle. Sólo las células madre dentales de la labial CL dan lugar a ameloblastos que generan esmalte, la cubierta externa de los dientes, en la superficie labial. Esta formación del esmalte asimétrica permite a la abrasión en la punta de los incisivos, y progenitores y células madre en el incisivo proximal asegurar que los tejidos dentales se reponen constantemente. La capacidad para aislar y cultivar estas células progenitoras o madre in vitro permite su expansión y abre las puertas a numerosos experimentos no alcanzables in vivo, tales como High prueba de rendimiento de los factores de regulación potencial de células madre. A continuación, describimos y demostrar un método fiable y consistente para las células de cultivo de la CL labial del incisivo ratón.

Introduction

Una de las características únicas de los vertebrados es la evolución de los dientes. El diente se ha convertido en un importante sistema modelo para muchas áreas de investigación, como las vías moleculares y especializaciones morfológicas relevantes a este órgano se han investigado desde varias perspectivas, incluso por los biólogos del desarrollo y evolución ^5. Más recientemente, el campo de la medicina regenerativa ha comenzado a obtener información valiosa utilizando el diente como modelo. En particular, el descubrimiento de las células madre epiteliales dentales ha sido un importante avance ^6-13.

Todos los roedores tienen incisivos de crecimiento continuo cuyo crecimiento es impulsado por las células madre, por lo que estos dientes un modelo de sistema accesible para estudiar la regulación de células madre adultas. Experimentos de etiquetado en la década de 1970 ^10,11, seguido de linaje genético experimentos de rastreo ^8,9,12,14, han demostrado que DESCs residen en la región proximal del incisivo. El vástagoprogenie de células en el compartimiento epitelial en el lado labial movimiento fuera del nicho putativo, conocido como el bucle de cuello uterino labial (CL), y contribuir a una población de células llamadas de tránsito de amplificación de células (TA) (Figura 1). Específicamente, DESCs residen en el epitelio externo del esmalte (OEE) y retículo estrellado (SR) ^8,9,14, y el epitelio interno del esmalte (IEE) da lugar a las células de AT que progresan a través de un número limitado de ciclos celulares y luego mueven distalmente a lo largo de la longitud del incisivo (Figura 1). Los ameloblastos de diferenciación en el incisivo ratón continúan moviéndose distalmente a lo largo del incisivo a un ritmo notable de aproximadamente 350 micras en un solo día ^15,16. Mientras se mueven, las células se diferencian en ameloblastos maduros y células estrato intermedio (SI). Después de depositar el espesor completo de la matriz del esmalte, muchos de los ameloblastos someterse a la apoptosis, y las células restantes se encogen en tamaño y regulan maduración del esmalte <sup> 17. El linaje de los otros tipos de células en el labial CL, como el SR, es menos clara, y los datos con respecto a las células madre en el mesénquima ^{de 18 años} y en la lingual CL sólo están comenzando a emerger.

Utilizando el modelo de ratón incisivo, un número de grupos han trabajado para dilucidar las vías genéticas y los procesos biológicos de células que participan en la renovación de órganos basado en células madre natural. Sin embargo, el labial CL contiene un número relativamente pequeño de células, estimada en aproximadamente el 5,000 por incisivo ratón, lo que hace que el trabajo con células primarias desafiante. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para la cultura y expandir estas células in vitro ^6,16,19,20 con el fin de abrir nuevas puertas a los enfoques experimentales que no son alcanzables in vivo. El estudio más reciente ha demostrado que estas células pueden tanto auto-renovarse y diferenciarse en células que expresan amelogenina cuando se cultivan ^13. A continuación, describimos y demostrar un método para the cultura fiable y consistente de las células de la labial ratón CL.

Protocol

1. Dissect Menores Hemi-mandíbulas de Adultos Mouse Antes de realizar este protocolo, obtener la aprobación institucional necesario y asegúrese de cumplir con todas las directrices de cuidado de animales. La eutanasia a los animales utilizando el estándar aprobado por el IACUC procedimientos. Para este trabajo se utilizó asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. OPCIONAL: Cabeza separada del resto del cuerpo, utilizando una hoja de afeitar. Quite la piel d…

Representative Results

El ratón hemimandíbula comprende un continuo crecimiento de los incisivos y molares tres raíces (Figura 1A). Todos los dientes se componen de la dentina y el esmalte, los dos componentes mineralizados de la corona del diente (Figuras 1a y 1a '). Las casas incisivos dos nichos de células madre llaman la CL labial y lingual CL, y el esmalte se forma exclusivamente en el lado labial (Figura 1A '). DESCs son responsables de la formación del esm…

Discussion

Las células epiteliales fueron primero cultivadas con éxito hace más de 40 años ^21-24, y más recientemente, el aislamiento con éxito de células madre epiteliales ^25-27 ha avanzado nuestro conocimiento de la biología epitelial. Se presenta un protocolo para aislar el DESCs del incisivo ratón adulto, una población relativamente poco estudiado de las células madre que tiene el potencial de producir importantes conocimientos sobre la biología y la formación del esmalte dental. Este protoco…

Materials

Forceps, size 5	Fine Science Tools	11251-30	FST by Dumont, Dumoxel,
Forceps Straight, fine, 3.5	Roboz	RS5070
Razorblades	Electron Microscopy Services	#71960
Scalpel Handle No.3	VWR
Feather Blade No. 15	Electron Microscopy Services	#72044-15	Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered	Worthington Biochemical Corporation	#4214
Insulin syringe	BD	#329424
Accumax	EMD Millipore	#SCR006
DMEM/F12	Gibco	11320-033
EGF	R&D	2028-EG-200
FGF2	R&D	233-FB-025
B27 Supplement	Gibco	10889-038