DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot katlanması ve Karakterizasyonu
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
DNA nanorobot içinde münzevi belirli uyaranlara ve mevcut kargo yanıt açmak için tasarlanmış bir oyuk altıgen nanometrik cihazdır. Her iki uyaranlara ve kargo özel ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir. Burada DNA origami tekniği ile, bir DNA nanorobot imalat protokol açıklar. Prosedür daha sonra bir katlama tampon maddesinin mevcudiyetinde, uzun dairesel, tek sarmal bir DNA iskele eklenir stok karışımı içine kısa tek kordonlu bir DNA zımba karıştırılmasıyla başlatır. Standart termo cycler giderek nanorobot katlanması arkasındaki temel güçtür zımba-to-iskele tavlama, kolaylaştırmak için karıştırma reaksiyon sıcaklığını düşürmek için programlanmıştır. 60 saat katlama Reaksiyon tamamlandıktan sonra, fazla zımba agaroz-jel elektroforezi (AGE) ile görselleştirme, ardından bir santrifüj filtre kullanılarak atılır. Son olarak, nanorobot başarılı imalat (TEM) transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulanır,Negatif bir boya olarak uranil-format kullanılarak.
Introduction
Nükleik asitler nanoteknoloji için kullandığı şaşırtıcı. Watson-Crick baz eşleştirme tractability olarak ısmarlama oligoların 2 büyük ölçekli sentezi kolaylığı ve nispeten düşük maliyetli bir DNA nanoteknoloji alanında uygulamalar 3 patlamasını ve araştırma üretti. Temel yapı taşı olarak hareketsiz Seeman kavşak 4,5'ten dayalı yapısal DNA nanoteknoloji, keyfi şekilleri 6-8 inşası için bir öz-montaj ilköğretim ünite olarak DNA kullanımını kolaylaştırır.
Desteksiz DNA origami 9 tekniğin son gelişme alt nanometre hassasiyetle karmaşık 2D / 3D nano mimarileri 10-12 inşası için izin verir ve artan karmaşıklığı ve şaşırtıcı çeşitliliği ile yeni işlevsel nesneler oluşturmak için etkili bir yoldur. Inşaat süreci uzun skafold, tek iplikli DNA dayanır, genellikle viral genom türetilmişKısa tek iplikli DNA oligo yüzlerce melezleşme yoluyla katlanabilir, e zımba denilen. Fabrikasyon tekrarlanabilirliği elde maksimum hidrojen bağlayıcı tamamlayıcılık kolaylaştırmak için kısa, tek iplikli zımba dizileri terzilik sonucu ise bu teknikle elde edilen yüksek çözünürlüklü yapısal, DNA çift sarmal doğal boyutlarının doğrudan bir sonucudur. Yavaş sıcaklık tavlama kullanımı ile termodinamik tercih nanoyapı yüksek verim ve sadakat ulaşılır tasarlanmış düşük-enerji, rampa. Bir bilgisayar kodu kavşak tasarım kurallarının uygulanması son derece kolay bağlanan kavşaklar yüzlerce içeren büyük, karmaşık yapıların tasarlama görevi kolaylaştırmak gibi caDNAno 13 olarak CAD araçları, gelişmesini, etkin.
Daha önce caDNAno aracı 14,15 yardımıyla bir DNA nanorobot tasarımını tarif. Burada imalat tasvir vetransmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirme, boyutları nanorobot 3B, içi boş altıgen nanodevice, önceden tespit edilmiş bir uyarım ve mevcut spesifik yük, yanıt olarak büyük bir uygun bir değişiklik geçiren için tasarlanmış 35 x 35 x 50 mil 3, örneğin protein ya da nükleik asit oligo olarak içeri birikir. 12 yükleme istasyonu boş kasanın içinde mevcut olmakla birlikte, bağlı yüklerin gerçek sayısı kargo boyutu ile değişir. Kargo molekülleri küçük DNA moleküllerinden enzimler, antikorlar ve 5-10 nm altın nanopartiküller değişir. Her nanorobot farklı moleküllerin bir karışımını ihtiva ettiği şekilde, muntazam ya da heterojen Cargocan ya. Algılama aptasensor 16,17 veya DNA zincir yerinden 18 teknolojiler üzerinde ya, proteinler, nükleik asitleri ve diğer kimyasalları anlamda iki çift sarmal kilitleme kapıları tasarım yoluyla elde dayanmaktadır. Aptamer seçimi protokolleri 19-21 son gelişmeler yanıt nanorobots tasarımını sağlayanmoleküller ve hücre tipleri artan aralığı.
Daha önce eser, antijene bağlanma önleyici bir ya da karma hücre grubunun 15 belirli hücre tipleri içine verimli bir sinyal, ya geçirebilmesi üzerine spesifik bir antikor, bir taşıma nanorobot göstermiştir. Bu nanocihazların bir heyecan verici özelliği, tek bir popülasyonda farklı nanorobot alt tiplerinin tanıtımıyla daha karmaşık görevleri ve mantık kontrolü gerçekleştirmek için yeteneğidir. Son zamanlarda aktif kargo molekülü 22 içeren bir efektör nüfus kontrol pozitif veya negatif düzenleyiciler ya da performans nanorobots belirli alt tipleri gösterdi.
Burada sunulan protokol nanorobot 15,22 açılmasını kolaylaştırmak için PDGF'ye seçici olarak bağlanan aptamer sensör dizileri ile işlenir bir nanorobot imalatı, saflaştırma ve görüntüleme açıklanmaktadır. Açıklanan imalat süreci n benzerverim ve arıtma oranlarını artırırken anorobot fabrikasyon süreci başlangıçta, Douglas ve arkadaşları ark., genel işlem süresini azaltmaya yönelik değişikliklerle 15 ile tasvir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz DNA nanorobot imalatı, arıtma, ve görselleştirme nitelendirdi. Cihazın altıgen şasi imalatı takiben, nanorobot fonksiyonu kolayca nedeniyle mevcut tek iplikli yerleştirme siteleri 14 ile hidrojen bağlayıcı tamamlayıcılık onların belirlenen pozisyon bulmak robot özgü kargo basit giriş ve algılama ipliklerini ile programlanır , 15,22.
Tarif edilen imalat protokolü, genellikle origami şekilleri geniş bir katlama laboratuarımızda kullanılmış…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar son derece değerli tartışmalar ve tavsiyeler ve yararlı tartışmalar ve iş için Bachelet laboratuarında tüm üyeleri S. Douglas teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Bar-Ilan Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi ve Nanoteknoloji ve İleri Malzeme Enstitüsü hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
