Vikning och karakterisering av en Bio-lyhörd robot från DNA Origami
Summary
DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).
Abstract
DNA nanorobot är en ihålig hexagonal nanometrisk enhet, utformad för att öppna som svar på specifika stimuli och nuvarande last sekvestrerade inuti. Både stimuli och gods kan skräddarsys efter specifika behov. Här beskriver vi DNA nanorobot tillverkningsprotokoll, med användning av DNA-origami teknik. Proceduren initieras genom att blanda korta enkelsträngade DNA-häftklamrar i en förrådsblandning vilken sedan sättes till en lång, cirkulär, enkelsträngad DNA-byggnadsställning i närvaro av en veckningsbuffert. En standardtermocykelanordningen är programmerad för att gradvis sänka blandningsreaktionstemperaturen för att underlätta häftklamrar till byggnadsställning glödgning, som är den ledande kraften bakom vikningen av nanorobot. När väl 60 tim fällbara reaktionen är fullständig, är överskotts häftklamrar kasseras med användning av ett centrifugalfilter, följt av visualisering via agaros-gelelektrofores (AGE). Slutligen är framgångsrik tillverkning av nanorobot verifierades genom transmissionselektronmikroskopi (TEM),med användning av AUC-format som negativa fläcken.
Introduction
Användningsområdena för nukleinsyror nanoteknik är häpnadsväckande. Den spårbarhet av Watson-Crick basparning samt den lätthet och relativt låga kostnad för storskalig syntes av skräddarsydda oligos 2 har genererat en explosion av ansökningar 3 och forskning inom DNA nanoteknik. Strukturell DNA nanoteknologi, baserat på den orörliga Seeman korsning 4,5 som en grundläggande byggsten utnyttjar DNA som en självsamlande elementärenhet för konstruktion av godtyckliga former 6-8.
Den senaste tidens utveckling bygga ställning DNA origami 9 teknik möjliggör för byggandet av komplexa 2D / 3D nano arkitekturer 10-12 med sub-nanometer precision och är en effektiv väg för att bygga nya funktionella föremål med ökande komplexitet och häpnadsväckande mångfald. Byggprocessen bygger på en lång klätterställning enda DNA, vanligen härrör från en viral GENOMe, som kan vikas genom hybridisering av hundratals korta enkelsträngat DNA oligos benämnda häftklamrar. Den höga strukturella upplösning som erhålls genom denna teknik är ett direkt resultat av de naturliga dimensionerna hos DNA-dubbelspiralen, medan reproducerbarheten för tillverkningen är ett resultat av att skräddarsy de korta enkelsträngade stapel sekvenser för att underlätta maximal vätebindnings komplementaritet uppnås. Med hjälp av en långsam temperatur glödgning ramp utformade lägsta energi, termodynamiskt föredragna nanostruktur uppnås i höga utbyten och trohet. Den enkel implementering av kopplingsdesignregler i en datorkod möjliggjort utvecklingen av CAD-verktyg, såsom caDNAno 13, som extremt förenkla uppgiften att utforma stora komplexa strukturer som innehåller hundratals anslutna korsningar.
Tidigare har vi beskrivit konstruktionen av en DNA-nanorobot med hjälp av caDNAno verktyget 14,15. Här skildrar vi tillverkning ochvisualisering, via transmissionselektronmikroskop (TEM), av nanorobot, en 3D ihålig hexagonal nanoanordning, med måtten 35 x 35 x 50 nm 3, som avser att genomgå en stor strukturförändring som svar på en förutbestämd stimuli och detta särskilda last, till exempel som proteiner eller nukleinsyra oligos, binds inuti. Medan 12 laddningsstationer finns inuti den ihåliga chassi, det faktiska antalet bunden last varierar med laststorlek. Cargo molekyler varierar från små DNA-molekyler enzymer, antikroppar och 5-10 nm guldnanopartiklar. Cargocan antingen vara enhetligt eller heterogen, så att varje nanorobot innehåller en blandning av olika molekyler. Sensing sker via två dubbelspiral låsspärrarna design för att känna av proteiner, nukleinsyror eller andra kemikalier, bygger antingen på aptasensor 16,17 eller DNA-sträng förskjutning 18 tekniker. Den senaste utvecklingen inom aptamer urval protokoll 19-21 möjliggöra utformningen av nanorobotar svaratill ett ständigt ökande urval av molekyler och celltyper.
Tidigare arbete visade en nanorobot uppbär en specifik antikropp, som vid bindning till dess antigen kan förmedla antingen en hämmande eller en produktiv signal till insidan av specifika celltyper i en blandad cellpopulation 15. Ett spännande inslag i dessa nanomaskiner är deras förmåga att utföra ännu mer komplexa uppgifter och logik kontroll med införandet av olika nanorobot subtyper i en enda population. Nyligen visade vi specifika subtyper av nanorobotar utför som antingen positiva eller negativa regulatorer, styra en effektor befolkningen innehåller en aktiv last molekyl 22.
Protokollet presenteras här beskriver tillverkning, rening och avbildning av en nanorobot gated med aptamer sensor sekvenser som binder selektivt till PDGF för att underlätta öppnandet av nanorobot 15,22. Tillverkningsprocessen beskrivs liknar de nanorobot tillverkningsprocess initialt visas av al. Douglas et 15 med ändringar som syftar till att minska den totala processtiden, och samtidigt öka avkastningen och reningshastigheter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskrev tillverkning, rening, och visualisering av DNA nanorobot. Efter tillverkningen av sexkantiga chassi enheten är funktionen hos nanorobot programmerats med enkel introduktion av specifik last och avkänning strängar till roboten som lätt finner sin utsedda läge på grund av vätebindnings kompletterar med tillgängliga enkelsträngsdockningsplatser 14 , 15,22.
Tillverknings protokoll som beskrivits använder en långsam glödgning ramp, som i allmänhet används i vå…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka S. Douglas för extremt värdefulla diskussioner och råd, och alla medlemmar i Bachelet labbet för hjälpsamma diskussioner och arbete. Detta arbete stöds av bidrag från fakulteten för biovetenskap och Institutet för Nanoteknik och Advanced Materials vid Bar-Ilan University.
Materials
| DNase/RNase free distilled water | Gibco | 10977 |
| M13mp18 ssDNA scaffold | NEB | N4040S |
| 10x TAE | Gibco | 15558-042 |
| 1 M MgCl2 | Ambion | AM9530G |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filter 100K MWCO | Amicon | UFC510024 |
| Agarose | Promega | V3125 |
| TBE buffer | Promega | V4251 |
| Ethidium bromide 10mg/ml solution | Sigma Aldrich | E1510 |
| 1 kb DNA marker | NEB | N3232S |
| Loading Dye | NEB | B7021S |
| uranyl formate | polysciences | 24762 |
| carbon-coated TEM grids | Science services | EFCF400-Cu-50 |
| Thermal Cycler c1000 Touch | Bio-Rad | |
| Glow Discharge K100X | Emitech | |
| UV table Gel Doc EZ Imager | Bio-Rad | |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | |
| TEM FEI-G12 | Tecnai |
References
- Watson, J. D., Crick, F. H. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature. 171, 964-967 (1953).
- Kosuri, S., Church, G. M. Large-Scale de novo. DNA synthesis: technologies and applications. Nature Meth. 11 (5), 499-507 (2014).
- Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology. Nature Nanotech. 6 (12), 763-772 (2011).
- Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J Theor Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
- Chen, J. H., Seeman, N. C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. Nature. 350 (6319), 631-633 (1991).
- Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
- He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
- Yin, P., Hariadi, R. F., Sahu, S., Choi, H. M. T., Park, S. H., Labean, T. H., Reif, J. H. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
- Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
- Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
- Douglas, S. M., et al. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
- Zhang, F., Nangreave, J., Liu, Y., Yan, H. Structural DNA nanotechnology: state of the art and future perspective. J Am Chem Soc. 136 (32), 11198-11211 (2014).
- Douglas, S. M., et al. Prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Res. 37 (15), 5001-5006 (2009).
- Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. J Vis Exp. (77), e50268 (2013).
- Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
- Tan, W., Donovan, M. J., Jiang, J. Aptamers from cell-based selection for bioanalytical applications. Chem Rev. 113 (4), 2842-2862 (2013).
- Xiang, D., et al. Nucleic Acid Aptamer-Guided Cancer Therapeutics and Diagnostics: The Next Generation of Cancer Medicine. Theranostics. 5 (1), 23-42 (2015).
- Zhang, D. Y., Seelig, G. Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions. Nat Chem. 3 (2), 103-113 (2011).
- Tang, Z., Parekh, P., Turner, P., Moyer, R. W., Tan, W. Generating aptamers for recognition of virus-infected cells. Clin Chem. 55 (4), 813-822 (2009).
- Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Prot. 5 (6), 1169-1185 (2010).
- McKeague, M., DeRosa, M. C. Challenges and Opportunities for Small Molecule Aptamer Development. J Nucleic Acids. 2012, (2012).
- Amir, Y., et al. Universal computing by DNA origami robots in a living animal. Nature Nanotech. 9 (5), 353-357 (2014).
- Castro, C. E., et al. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Meth. 8 (3), 221-229 (2011).
- Sobczak, J. P., Martin, T. G., Gerling, T., Dietz, H. Rapid folding of DNA into nanoscale shapes at constant temperature. Science. 338 (6113), 1458-1461 (2012).
- Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12735-12740 (2014).
- Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Res. 41 (2), (2012).
- Bai, X. C., Martin, T. G., Scheres, S. H., Dietz, H. Cryo-EM structure of a 3D DNA-origami object. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20012-20017 (2012).
