Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme
Summary
Bu makale Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskobu (SIM) kullanılarak in vitro hipokampalinden görüntü dendritik dikenler bir çalışma protokolünü açıklar. SIM kullanarak süper çözünürlüklü mikroskopi geliştirilmiş detaylar bireysel dendritik dikenler görüntüleme sağlayan, önemli ölçüde her üç boyutta ışık kırınım sınırı aşan görüntü çözünürlüğü sağlar.
Abstract
Dentritik dikenler bir nöronun dendrit çıkan çıkıntılar ve beyinde uyarıcı girdilerin birincil postsinaptik hedeflerini temsil eder. Teknolojik gelişmeler nöron bağlantısı ve sinaptik plastisite kilit unsurlar olarak bu yapıları belirledik. Işık mikroskopisi kullanılarak omurga morfolojisi kantitatif analiz dolayı ışığın intrinsik kırılma limitli ilgili teknik sınırlamalara önemli bir problem olmaya devam etmektedir. Dentritik dikenler kolayca konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Uzunluğundan daha başka omurga boyutları genellikle 200 nm ışık mikroskobu teorik çözünürlük limiti ile sabit bir geleneksel optik çözünürlük daha küçüktür Ancak, dikenler şekil ve boyut olarak ince değişiklikleri ölçmek zordur.
Yakın zamanda geliştirilen birçok süper çözünürlük teknikleri dendritik dikenler de dahil olmak üzere 200 nm 'den daha küçük bir görüntü hücresel yapılara kullanılmıştır. THese teknikleri klasik uzak alan işlemlere dayalı ve bu nedenle bir numunenin yüzeyinin ötesine mevcut numune hazırlama yöntemlerinin ve görüntü kullanımına izin verir. Burada anlatılan primer hipokampal nöron kültürlerinde dendritik dikenler görüntüleme süper çözünürlük yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) uygulamak için bir çalışma protokoldür. SIM Olası uygulamalar konfokal mikroskopi olanlar ile örtüşmektedir. Ancak, iki teknik farklı uygulanabilirliğini sunmak. Konfokal mikroskopi nedeniyle fiziksel bir iğne deliği kullanımına, odak ışığın dışarı çıkarılma pahasına çözünürlük iyileşme elde ederken SIM, daha etkin yanal çözünürlük sunuyor. Bu protokol, birincil nöronlar DNA plasmidleri floresan proteinleri kodlayan ve SIM kartını kullanarak görüntülü ile transfekte edilmiş bir standart protokol kullanılarak cam lameller üzerinde kültürlenmiştir. Dendritik dikenler, in vitro olarak 16-17 gün sonra, ne zaman görüntülü, çünkü burada tarif edilen tüm protokol, yaklaşık olarak 2 hafta sürerdendritik gelişim uygunudur. Protokolünün tamamlanmasından sonra, dendritik dikenler özel yazılımlar kullanarak, SIM görüntü yığınlarının serisinin 3D olarak yeniden inşa edilebilir.
Introduction
Bir dendritik omurga nöron zarın küçük bir çıkıntı olduğu. Bu karakteristik yapı, genellikle tek bir sinaps giriş almak için uzman ve iki nöronlar arasındaki fiziksel temas alanını temsil eder. En çok işlevsel olgun dendritik dikenleri bir küresel ucu, kafa olarak adlandırılan ve dendritik mile baş bağlayan ince bir boyun içerir. Ancak, dikenler statik değildir ve aktif hareket ve hatta yetişkin beyninde 2 sürekli kendi morfolojisi değiştirin. Bir zaman 2 haftalık süre içinde, geç embriyonik ya da erken doğum sonrası zaman türetilmiş sıçan primer hipokampal nöron kültürleri omurga benzeri yapıların 3 erken filipodia gelişmeye çok sayıda membran çıkıntılar ile karmaşık dendritik milleri gelişir. Bu dinamik davranış ve diğer özelliklerine göre, dendritik dikenler bellek depolama ve sinaptik transmisyon 4,5 'için anatomik bir alt-tabaka temin ettiği düşünülmektedir.
Inci göz önüne alındığındadendritik omurga boyutu ve şekli sinaptik fonksiyon, doğru boyutlarını ölçmek için önemli olduğunu e kritik rolü. Dikenler uzunluğu yaklaşık 200 ile 2000 nanometre arasında değişir ve hali hazırda konfokal lazer tarama floresan mikroskobu ile tespit edilebilir. Ancak, uzunluğu dışındaki omurga boyutları genellikle teorik 200 nanometre yaklaşık 6 difraksiyonu ile sabit geleneksel optik sistemlerinin çözünürlük, aşağıda belirtilmiştir. Bu çözme güçler, omurga boyunları ve kafaların genişliği gibi ince ayrıntıları, görüntüleme için yetersizdir. Çok iş bu sorunu çözmek için tahsis edilmiştir ve birçok nispeten yeni süper çözünürlük mikroskopi teknikleri önemli bir ilerleme sağladı. Özellikle, bir geniş alan, non-konfokal mikroskop 7-10 yanal olarak yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanarak herhangi bir ışık emisyon göz ardı etmeden, klasik sınırı aşan bir çözünürlük elde etmek mümkündür. Non-linea ile birlikte bu teknik kullanılarak,r mikroskopi teknikleri, sınırsız bir faktör 11 ile optik mikroskop yanal çözünürlüğü artırmak için teorik olarak mümkündür. Bununla birlikte, pek çok deneysel koşullar altında, iki 1 SIM bir faktör ile çözünürlük limiti aşmak için izin verir. Böyle uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskopi 12 ve foto-aktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) 12 gibi diğer süper çözünürlüklü optik mikroskopi teknikleri dendritik dikenler görüntüleme uygulandı. Palmiye gibi yerelleştirme-tabanlı yöntemler süper çözünürlük elde etmek için ham görüntülerin çok sayıda gerektirir ve bu nedenle hız sınırlıdır. Öte yandan, STED'in, yüksek görüntüleme hızı elde edebilirsiniz nispeten düşük foton sayıları ve SIM 13 için böyle olmayabilir bakış küçük alanlarda, rağmen.
Bu yazıda amacı, in vitro kültürlenmiş fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için çalışan bir protokol sunmaktır </em> SIM kullanarak. Kurulması, geliştirilmesi, transfeksiyonla ve sıçan primer hipokampal nöron kültürlerin imünohistokimyası ve görüntüleme örnek adanmış bir geç fazda oluşan bir ilk bir: Protokol, iki ayırt aşamadan oluşmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda SIM kartını kullanarak, in vitro olarak kültürlenen fare birincil hippokampal nöronlar görüntü dendritik dikenler için bir çalışma protokolü tarif edilmektedir. Primer hipokampal nöron kültürü yöntemi KAECH ve Banker 18 tarafından açıklanan orijinal yönteminin bir uyarlamasıdır. Brewer ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi 19 ana fark, Neurobasal/B27 kültür astroglial besleyici kültürlerin ortam gereksinimini ortadan kaldırır, ve g…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma CPF Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO) bir VIDI hibe sayısı H64.09.016 tarafından finanse edilmiştir. CPF onun eleştirel yorumlar ve taslakla ilgili düzeltmeler için Dr Silvina A. Fratantoni minnettardır. GMRDL / Emmm Hollandalı Teknoloji Vakfı NWO parçasıdır STW (proje 12151 ve 11350), ve hangi kısmen Ekonomik İşler Bakanlığı tarafından finanse edilmektedir tarafından desteklenmektedir. Biz yardım ve destek için Nikon Instruments Europe BV Catherine Kitts ve Peter Drent teşekkür ederim. HX hibe Bilimsel araştırma için Hollanda Örgütü (hibe 820.02.006) tarafından desteklenen Royal Dutch Sanatları ve Bilimleri Akademisi (hibe 11CDP10) ve WT tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Fine forceps | |||
| Big forceps | |||
| Fine scissor | |||
| Big scissor | |||
| Blunt spatula | |||
| Dissecting microscope with illumination | |||
| Light microscope | |||
| 37 °C water bath | |||
| Laminar flow cell culture hood | |||
| High-temperature dry-oven | |||
| Bunsen burner | |||
| Cell culture incubator (5% CO2, 37 °C) | |||
| Microcentrifuge | |||
| Orbital shaker | |||
| Nikon structured illumination microscope setup consisting of: | |||
| Nikon Eclipse Ti research inverted microscope with Perfect Focus System | |||
| Nikon CFI Apo TIRF 100x oil objective lens (N.A. 1.49) | |||
| 4 Coherent Sapphire Lasers (458, 488, 514 and 561 nm exitation wavelength) | |||
| SIM Illuminator | |||
| Nikon Stage Controller | |||
| MCL Nano-Drive piezo controller | |||
| Nikon Intensilight C-HGFIE mercury lamp | |||
| SIM Microscope Enclosure temperature control | |||
| Andor EM-CCD Camera iXon DU897 | |||
| PC with Microsoft Windows 7 Home Edition | |||
| Nikon’s NiS Elements 6.14 SIM software package | |||
| Nikon type A immersion oil |
References
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microsc. 198, 82-87 (2000).
- Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. Dendritic spine formation and stabilization. Curr Opin Neurobiol. 19, 146-153 (2009).
- Dailey, M. E., Smith, S. J. The dynamics of dendritic structure in developing hippocampal slices. J Neurosci. 16, 2983-2994 (1996).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61, 85-100 (2009).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9, 413-418 .
- Gustafsson, M. G., Agard, D. A., Sedat, J. W. I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc. 195, 10-16 (1999).
- Heintzmann, R., Cremer, C. G. Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating. Proc. SPIE 3568 Optical Biopsies and Microscopic Techniques III. , 185-196 (1999).
- Karadaglić, D., Wilson, T. Image formation in structured illumination wide-field fluorescence microscopy. Micron. 39, 808-818 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320, 1332-1336 (2008).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13081-13086 (2005).
- Nagerl, U. V., Willig, K. I., Hein, B., Hell, S. W., Bonhoeffer, T. Live-cell imaging of dendritic spines by STED microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 18982-18987 (2008).
- Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination. Nat Methods. 6, 339-342 (2009).
- James, C. D., et al. Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. IEEE Trans Biomed Eng. 47, 17-21 (2000).
- Dumitriu, D., Rodriguez, A., Morrison, J. H. High-throughput, detailed, cell-specific neuroanatomy of dendritic spines using microinjection and confocal microscopy. Nat Protoc. 6, 1391-1411 (2011).
- Fitzsimons, C. P., et al. Knockdown of the glucocorticoid receptor alters functional integration of newborn neurons in the adult hippocampus and impairs fear-motivated behavior. Mol Psychiatry. , (2012).
- van Hooijdonk, L. W., et al. Lentivirus-mediated transgene delivery to the hippocampus reveals sub-field specific differences in expression. BMC Neurosci. , (2009).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Izeddin, I., et al. Super-resolution dynamic imaging of dendritic spines using a low-affinity photoconvertible actin probe. PLoS ONE. 6, (2011).
