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Bio-ingénierie

입자 추적 microrheology은을 사용하여 3D 종양 모델에서 세포 외 매트릭스 강성의 경도 측정

Published: June 10, 2014
doi:
10.3791/51302
, , ,
1Department of Physics,University of Massachusetts Boston

Summary

입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

기계 미세 자체가 리모델링 복잡한 양방향 mechanosensitive 상호 작용의 한 부분으로서 수정 종양의 성장 동작 및 신호의 중요한 규칙, 역할을 보여왔다. 생물학적으로 중요한 3D 종양 모델의 개발은 종양 성장에 대한 매트릭스의 레올 로지에 미치는 영향에 대한 역학적 연구를 촉진하고 있지만, 종양에 의해 유도 된 기계적 환경 매핑 변화의 역 문제는 도전 남아있다. 여기, 우리는 종 방향으로 현장에서, 종양 미세 환경의 물리적 변화를 모니터링하기위한 강력하고 실행 가능한 접근 방법의 일환으로 췌장암의 3D 모델과 함께 입자 추적 microrheology은 (PTM)의 구현을 설명합니다. 여기에 설명 된 방법론과 형광 표지 프로브가 균일하게 포 배포 모델 세포 외 기질 I 콜라겐 유형의 (ECM) 지지체에 포함 체외 3D 모델을 준비하는 시스템 통합구성비와 표본 전체에 시간에 따른 microrheology은 측정. 체외 종양 도금 및 멀티 웰 이미징 플레이트를 사용하여 병렬 상태에서 조사됩니다. 정해진 방법에 그리기, 추적 조사의 움직임 동영상은 복잡한 주파수 의존 점탄성 전단 계수, G * (ω)를보고하는 일반화 된 스톡스 아인슈타인 관계 (GSER)를 통해 변환됩니다. 이 방법은 이미지를 기반으로하므로, 기계적 특성도 동시에 3D 종양의 크기와 표현형의 질적 변화를보고 큰 투과광 공간 필드에 매핑됩니다. 현지화 침입에 의한 매트릭스 저하뿐만 아니라 시스템 교정과 관련된 하위 지역에 기계 응답을 대조 보여주는 대표적인 결과는 검증 데이터가 제공됩니다. 일반적인 실험 오류와 이러한 문제의 문제 해결에서 바람직하지 않은 결과도 제시된다. 이 프로토콜에서 구현 된 96 – 웰 배양 판 3D 포맷는 C치료 심사 분석 또는 기계적 미세 환경에 대한 치료 또는 생화학 적 자극의 영향에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 분자 이미징 microrheology은 측정의 상관 관계에 onducive.

Introduction

그것은 암 세포가 아닌 악성 포유류의 상피 세포에서와 같이, 주변의 세포 외 기질 (ECM) 및 기타 미세 환경의 구성 요소 1-9의 기계 및 생물 물리학 적 특성에 매우 민감하다는 문헌 기록의 성장 몸에서 분명하다. 우아한 기계론의 연구는 악성 성장의 행동과 형태 형성 2,3,10,11을 조절하는 복잡한 mechanosensitive 신호 파트너로 세포 강성의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작품은 생물학적으로 관련 조직의 구조를 복원하고 조정할 수있는 기계와 발판 재료의 성장 및 광학 현미경 12-19으로 영상화 할 수있는 시험 관내 종양 모델에서 3D의 개발에 의해, 특히 촉진하고있다. 그러나, 종양 차례로 암 세포가 자신의 주변의 레올 수정 통해 미세 사이 mechanoregulatory이 대화의 다른 쪽은, 다소 남아공부하기가 더 어렵다. 예를 들어, 침략 과정에서, 종양의 주변에서 세포 차례의 mechanosensitive 성장의 행동에 영향을 미치는 ECM 20-22의 지역이 저하 될 그 중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 거쳐 매트릭스 메탈로 (MMPs의)의 발현을 증가시킬 수 있습니다 다른 근위부 종양 세포. 생화학 다양한 공정을 통해 암 세포는 지속적으로 다른 시간에 서로 다른 프로세스에 맞춰 상하 그들의 환경의 로컬 강성 다이얼. 여기에서 설명하는 방법은 3D 종양 모델과 통합 문화를 종료하지 않고 생화학 적 표현형의 변화와 종 방향으로 상관 관계가 될 수있다 성장하는 동안 강성과 ECM의 준수 로컬 변경 사항을보고 분석 도구의 필요성에 의해 좌우된다.

이러한 맥락에서 구현하는 적절한 기술의 검색, 입자 추적 microrheology은 (PTM)가 강력한 후보로 나온다.이 방법은, 메이슨과 바이 츠 (23, 24)에 의해 처음 개척, 마이크론 길이의 비늘에서 주파수에 의존하는 복잡한 점탄성 전단 계수, G * (ω)을보고하기 위해 복잡한 유체에 포함 된 추적 프로브의 움직임을 사용합니다. 이러한 일반적인 접근 방식은 부드러운 응축 물질, 콜로이드, 생물 물리학 및 고분자 물리학 25-31에서 다른 응용 프로그램에 적합한 여러 변화와 함께 개발되었습니다. 지역 점탄성의 판독이 문화를 작성할 당시 통합과 성장의 확장 된 기간 동안 그 자리에 남아있다 화학적으로 비활성 추적 프로브의 비파괴 비디오 영상에 의해 제공되기 때문에 PTM은 다른 방법에 비해 어떤 장점이 있습니다. 이것이 반드시 문화의 종단이 필요하고 복잡한 3D 종양 microenvir 내의 포인트 측정보다는 샘플의 벌크 거시적 레올보고 진동형 전단 대량 레오 미터, 금 표준 측정 대조적이다일어나는 장소. 실제로 다수의 연구는 세포의 이동 (32), 확장 구형 (33), 세포 내 레올 로지 (34, 35)에 의해 유도 된 기계적 스트레스와 관련된 변형을 측정하는 또는 암 또는 비 암 세포 주위에 추적 프로브의 움직임 측정을 해석하는 유틸리티를 설명하고있다 기계적 응력과 변형 설계 조직 36, 기공 크기 및 침입 속도 (37) 사이의 관계를 매핑하는 방법. 예컨대 원자력 현미경 (AFM) 등 microrheology은 적합한 다른 기술들이 구현 될 수 있지만, 주로 또한 시료 표면에 점을 프로빙하고 대한 길이 측정 38을 복잡 배양 무균 문제를 일으킬 수있다.

여기에서 우리는 확실하게 공간을 매핑하기위한 비디오 입자 추적 및 분석 방법에 대한 포함 된 형광 프로브와 ECM에 전송하기에 적합한 3D 종양 상체의 성장을위한 방법을 포괄하는 종합적인 프로토콜을 설명문화 시간에 microrheology은 변화. 본 구현, 3D 종양 모델이 형식에 도움이되는 다른 전통적인 분석 (예를 들면, 세포 독성)와 microrheology은 측정의 결합으로 볼 수있는 멀티 웰 형식으로 재배하고 있습니다. PANC-1 세포를 사용하여이 방법의 우리 배양 시험관 차원 상체의이 대표적인 그림에서, 상체 (39) 만, 본원에 기재된 모든 측정을 형성하기 위해 알려진 확립 췌장암 세포주 세포주의 다양한 사용하여 고형 종양 연구 광범위하게 적용될 수있다 3D 문화에 적합합니다. 이 방법은 본질적으로 이미징을 기반으로하기 때문에 그것은 이상적으로 세포의 성장, 이동 및 표현형의 변화를보고보기의 큰 투과광 필드 고해상도 microrheology은 데이터의 공동 등록에 적합합니다. PTM의 구현은 현미경 스테이지 WH 재현성 위치 결정을 가정 이와 같이 투과광 현미경과 통합무형 문화 유산은 모터 상업 위드의 표면 형광 생물 현미경에 일반적으로 사용할 수 있습니다. 아래 개발 된 프로토콜은 합리적으로 장착 된 자동 형광 생물 현미경으로 구현 될 수있다. 이는 오프라인 처리를위한 디지털 비디오 현미경 기가 바이트의 데이터의 획득을 필요로하는 본질적으로 데이터 집약적 인 방법이다.

다음 프로토콜에서, 프로토콜 한 아가 로스 오버레이를 사용하여 여기에 설명되어 있지만, 이러한 매달려 드롭 40, 또는 41 회전 배양 기법과 같은 다른 다양한 방법으로 치환 될 수있는 종양 상체의 초기 제제에 관한 것이다. 프로토콜 2는 다른 방법으로, 체외 3D 종양 캡슐 또는 재 부유 세포의 매립 ECM 12,15에있는 것이 아니라 하나의 미리 형성된 비 부착 상체로 성장 할 수 있지만 콜라겐 지지체에 상체를 포함하는 프로세스를 설명합니다. 후속 프로토콜은 O를위한 절차에 대해 설명합니다각각의 비디오 현미경 데이터를 획득 및 처리하여 시간 분해 microrheology은 측정 btaining. 데이터 처리 (참조 http://www.physics.emory.edu/, MATLAB을 사용하여 원래 광범위하게 다양한 소프트웨어 플랫폼을 위해 개발 된 크로커와 그리어 (42)에 의해 설명 된 알고리즘을 기반으로 PTM을위한 오픈 소스 루틴의 활용 설명 ~ 주 / IDL /).

Protocol

1. 배양 종양 상체 1 % 아가로 오스 용액을 얻었다 아가 로스 0.1 g과 함께 세포 배양 등급의 물 10 ㎖를 혼합한다. 96 – 웰 플레이트에 잘으로 아가로 오스 솔루션의 40 μl를 분취하기 전에 70 ° C 이상 (표준 전자 레인지 나 가열 플레이트를 사용하여 약 14 초)에 열 아가로 오스 솔루션입니다. 표준 기술을 사용하여 세포를 수확하는 동안 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어…

Representative Results

G * 복잡한 모델 종양 미세 환경 내에서 지역화 된 위치에서 (ω) 측정의 유효성을 확인하기 위해 두 개의 초기 유효성 검증 실험을 실시 하였다. 첫째, 우리는 대량 진동 전단 레오 메타의 "황금 표준"에 대한 우리의 측정을 검증하기 위해 노력했다. 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐의 농도 (전지 제외) 콜라겐 매트릭스의 동일한 샘플을 준비했습니다. 이러한 샘플은 ( "(이 프로토콜…

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 세로 방향으로 3D 종양 모델에서 ECM의 강성 로컬 변경 사항을 추적하기위한 강력하고 광범위하게 적용 전략을 소개합니다. 우리는이 방법은 종양의 성장과 침략 과정에서 매트릭스 리모델링에 연루 mechanosensitive 행동에 관심이 암 생물학 및 생물 물리학 자에 의해 채택 될 수 있다는 구상. 행렬 분해 반응 속도의 정확한 정량화 직접 매트릭스 리모델링에 연결되어 3D 종양 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 기꺼이 (마리아 Kilfoil에서 제공하는 MATLAB 입자 추적 코드의 오픈 소스 공유 인정 http://people.umass.edu/kilfoil/ )를, 존 C. 크로커와 에릭이 제공하는 이전의 IDL 코드와 광범위한 설명서와 함께 R.의 주. 이 작품은 국립 암 연구소 (NCI / NIH), K99CA155045 및 R00CA155045 (: JPC PI)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다.

Materials

Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, California 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, California 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate  cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA
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References

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Citer Cet Article
Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).
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