Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Summary

Ascorbate משחק תפקידים חשובים רבים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם מגיע רק לאור בשנים האחרונות. כאן אנו מתארים בינוני תפוקה, assay microplate הספציפי וזול לקביעת שני ascorbate התוך וחוץ תאי בתרבית תאים.

Abstract

ויטמין C (ascorbate) ממלאת תפקידים רבים חשובים בחילוף חומרים תאיים, שרבים מהם יצאו לאור רק בשנים האחרונות. לדוגמא, בתוך המוח, ascorbate פועל באופן הגנה עצבי וneuromodulatory שכרוך רכיבה על אופניים ascorbate בין הנוירונים והאסטרוציטים vicinal – מערכת יחסים שנראה כחיוני להומאוסטזיס ascorbate המוח. בנוסף, יש ראיות המתעוררות מראות כי יש ascorbate תפקיד התרחב מאוד בויסות חילוף חומרים של ברזל תאי ומערכתיים יותר מוכר בסגנון קלאסי. ההכרה הגוברת בתפקיד נפרד של ascorbate בפיזיולוגיה תאית והאורגניזם נורמלי וחוסר פיקוח ממשלתי דורשת מגוון של טכניקות אנליטיות בינונית תפוקה ורגישות גבוהה שיכולות להתבצע ללא הצורך בציוד מומחה יקר מאוד. כאן אנו מספקים הוראות מפורשות למדיום תפוקה, assay microplate הספציפי וזול יחסית לקביעת בוascorbate התוך תאי וה בתרבית תאים.

Introduction

גילוי האופי הכימי של חומצה אסקורבית (ויטמין C), וזיהוי שלה בתור "הגורם אנטי scorbutic" המיוחל, על ידי אלברט Szent-ג'ורג'י ואחרים במאמרים שפורסמו 1928-1934 ¹ היה אירועי ציון דרך בהיסטוריה לביוכימיה. ואכן, תגליות אלה תרמו לSzent-ג'ורג'י שזכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 1937. החבילה המתרחבת של תפקידים לascorbate בפיזיולוגיה של בעלי חיים וצמחים, כמו גם על בריאות אדם, תמשיך להיות הנושאים מדעיים פעילים חקירה ומחלוקת.

L-Ascorbate הוא reductant פיסיולוגי בשפע ואנזים cofactor במערכות יונקים, ותורם לתגובות אנזימטיות מוגדרות היטב רבות מעורבים הידרוקסילציה קולגן, קרניטין וביוסינתזה נוראפינפרין, חילוף חומרים טירוזין והורמון פפטיד amidation ^2. מסקרן, evide הרכבהNCE עולה כי ascorbate משחק תפקיד בגירוי dioxygenases ברזל תלוי אחר, כגון hydroxylases prolyl וasparaginyl המעורב בהידרוקסילציה ומיקוד של גורמי היפוקסיה מושרה 1α (HIFs) ו2α ^3. דו"ח שפורסם לאחרונה מצביע על כך שascorbate משחק תפקיד בהבשלת תאי T המשפיע על דרך demethylation הכרומטין באמצעות פעילותו במגרת hydroxylases הגרעיני, Jumonji C חלבוני תחום (JmjC); האחרון שבם מופיעים לדרוש ascorbate לפעילות מלאה ^4. ואכן, הגירוי של אנזימים כגון על ידי ascorbate נראה להתרחש על ידי מנגנון דומה לגירוי על ידי ascorbate של hydroxylases HIF וקולגן. בין השפעות קלאסיות אחרות, ascorbate תורם באופן משמעותי לantioxidation הסלולרי כמחסל ⁵ רדיקלי מסיסים במים שבירת שרשרת ולמחזור של קרום הפלזמה α-טוקופרול (ויטמין E) באמצעות ההפחתה של α-tocopheroxyl ⁶ רדיקלי, Which חשוב בהגנה מפני חמצון של שומנים בממברנה ^7. חשוב מכך, למרות שרוב היונקים מסוגלים סינתזה כבדית דה נובו של ascorbate מD-גלוקוז, פרימטים גבוהים יותר, שרקנים ועוד כמה עטלפים תלויים במקורות תזונתיים של הוויטמין ^8. זאת בשל איון של גן GULO, orthologues אשר ביונקים מושפעים לקודד האנזים, γ-gulono-lactone מונואמין ^9-13. אנזים זה נדרש לתגובה האחרונה בביוסינתזה ascorbate ^מ13 גלוקוז.

בעקבות קליטה בתיווך טרנספורטר מלומן מעיים בבני אדם, ascorbate מופץ בכל הגוף על ידי מערכת הדם. הוויטמין נמצא בדרך כלל בצורה המצומצמת שלה בmillimolar ריכוזים intracellularly (עם החריג הבולט של אריתרוציטים שבריכוזים הם בדרך כלל דומים לריכוז הפלזמה הרווח), ובקונצרט כלשהו מייקרוentrations (למשל 50-200 מיקרומטר) ברוב הנוזלים תאיים ^14,15.

בתנאים פיסיולוגיים, ascorbate בדרך כלל עובר חמצון אחד אלקטרונים הפיכים לרדיקלי ascorbyl בחינם (AFR; הידוע גם בmonodehydroascorbate או semidehydroascorbate). בעוד AFR הוא ¹⁶ רדיקליים יציבים יחסית, בהיעדר הירידה המהירה שלה מאלקטרון אחד האנזימטית חזרה לascorbate, שתי AFRs יכול לקדם dismutate לascorbate אחד וdehydroascorbate אחד (DHA) ^9,13,17. בתוך הפנים של התא, מוצר חמצון שני אלקטרונים של ascorbate, DHA, ניתן להפחית במהירות בחזרה לascorbate ידי גלוטתיון וNAD (P) H האנזימטית תלויות ותגובות אינן אנזימטית ^13.

בזמן שהוא קיבל באופן קלאסי שהתפקיד המשמעותי היחיד של ascorbate במטבוליזם של ברזל הוא כדי לעורר ספיגה תזונתית של ברזל מהמקור צמחי ^18, אנחנו ואחרים סיפקנו ראיות שלtrongly מצביע ascorbate שמשחק תפקיד התרחב מאוד בחילוף החומרים של מתכת זו. ראשית, ascorbate כי הוא שוחרר על ידי תאי ascorbate-גדוש מופיע לשחק תפקיד חשוב בויסות הספיגה של ברזל שאינו מאוגד transferrin על ידי תאים ^19,20, וראיות מאוד לאחרונה עולה כי ascorbate גם מודולציה את הספיגה של ברזל בכריכת transferrin על ידי תאים ^21, האחרון שבם מתאים למסלול פיסיולוגי עיקרי ברזל ספיגת ^22.

Ascorbate הוא חיוני לתפקוד תקין של מערכת עצבים מרכזי ביונקי ^23,24. יחד עם luteum קליפת המוח, בלוטת יותרת המוח, בלוטת התימוס, הרשתית וקורפוס יותרת הכליה, המוח מכיל ריכוזים גבוהים של ascorbate יחסית לרקמות אחרות בגוף ^23,25-27. בנוסף, החשיפה של שני האסטרוציטים ^28,29 ותאים כמו נוירון ³⁰ לגלוטמט ידוע כדי לעורר את שחרורו של ascorbate לתוך חלל החוץ תאי, שם ascorbatהוא חשב דואר כדי לעזור להגן על נוירונים נגד תפקוד עצבי הנגרם גלוטמט ^{ביום 31.} בעוד המנגנון של שחרור ascorbate-Induced גלוטמט מהאסטרוציטים המדויק אינו ידוע, יש לנו לאחרונה סיפקנו ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי נפיחות נגרמת על ידי ספיגת גלוטמט על ידי גלוטמט astrocyte וטרנספורטר aspartate (GLAST; איזופורם הידוע גם חומצת אמינו מעוררת טרנספורטר 1 [EAAT1 ] בבני אדם) והפעלה הסוגר של osmolyte ואניון ערוצי נפח רגיש (VSOACs) שהם חדירים לאניונים אורגניים קטנים כגון ascorbate ^32. הזהויות מולקולריות של תעלות קרום הפלזמה מעורבות בהיווצרות VSOAC להישאר להיות מזוהות ^33,34.

למרות מבחני רבים פותחו לקביעת ascorbate בדגימות ביולוגיות, הכוללות מבחני spectrophotometric, fluorometric וchromatographic ^35,36, יש הרבה גיוון בסגולי, רגישות, interferencדואר על ידי מזהמים כימיים, טווח ליניארי אפקטיבי ויציבות של אנליטי נקודת הקצה. בנוסף, גורמים משמעותיים נוספים המשפיעים על הבחירה של assay הם מהירות, קל שימוש וגישה לציוד יחסית מיוחד כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים מנגנון (HPLC).

כאן אנו מציגים assay microplate colorimetric פשוט ומאוד ספציפי לקביעת ascorbate תאית בתאים בתרבית, כמו גם assay נפרד לקביעת ascorbate-זרימה מהתאים בתרבית. Assay האחרון נועד לעקוף את הבעיה של הערכה נמוכה מדי של שחרור ascorbate מהתאים עקב ספיגה מחדש מהירה של ascorbate שפורסם על ידי מובילי נתרן תלוי ascorbate (SVCTs). למרות ששתי השיטות האלה הופיעו בחלק מהפרסומים הקודמים שלנו ^{19,20,32,37,38,} כתב היד הזה מספק סט מפורש של הוראות והנחיות לביצוע היעיל שלהם.

Protocol

1. קבע Ascorbate תאיים בתאים בתרבית תרבית תאים וקציר לגדול השעיה (למשל erythroleukemia האנושי, K562) או תאים חסיד (למשל האסטרוציטים ראשוניים) באמצעות נהלי תרבות סטנ?…

Representative Results

קביעת Ascorbate תאית בתאי השעיה מתורבתים ב assay הראשון (איור 1), ascorbate תאיים נקבע, בעקבות ascorbate ספציפי הפחתה (AO רגיש כלומר) של ferricyanide לשל ברזל, תוך שימוש בנחישות רגישה מאוד של של ברזל על ידי הליך שפורסם בעבר 37. זיהוי של ascorb…

Discussion

במאמר זה אנו מציגים שני מבחני microplate colorimetric מהירים, ספציפיים ורגישים יחסית לקביעת ascorbate נגזר מתאי התוך וחוץ תאיים בתאים בתרבית. ניתן להשלים מבחני עם גישה לציוד מעבדה סטנדרטית וחומרים כימיים. מגיב רק יקר באופן מתון הנדרש לassay הוא AO, שהוא חיוני כפי שהוא מקנה גבוהה מידת הס…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate