Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Summary

Ascorbato desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Descrevemos aqui um meio-débito, ensaio de microplacas específico e de baixo custo para a determinação de ambos ascorbato intra e extracelular em culturas de células.

Abstract

A vitamina C (ácido ascórbico) desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Por exemplo, dentro do cérebro, o ácido ascórbico atua de forma neuroprotetor e neuromodulador que envolve ciclismo ascorbato entre astrócitos e neurônios vicinais – um relacionamento que parece ser crucial para ascorbato cérebro homeostase. Além disso, novas evidências sugerem fortemente que o ácido ascórbico tem um papel muito expandida na regulação do metabolismo do ferro celular e sistêmica do que é classicamente reconhecida. O crescente reconhecimento do papel fundamental do ascorbato na fisiologia celular e do organismo normal e desregulamentado exige uma gama de médio rendimento e de alta sensibilidade técnicas analíticas que podem ser executados sem a necessidade de equipamentos especializados altamente caro. Aqui nós fornecemos instruções explícitas para um meio-rendimento, ensaio de microplacas específico e relativamente barato para a determinação de boascorbato intra e extracelular th em cultura de células.

Introduction

A descoberta da natureza química do ácido ascórbico (vitamina C), e sua identificação como o "fator anti-escorbuto" há muito procurado, por Albert Szent-Györgyi e outros artigos publicados em 1928-1934 ¹ foram acontecimentos marcantes na história de bioquímica. De fato, essas descobertas contribuíram para Szent-Györgyi sendo agraciado com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1937. A suíte cada vez maior de papéis para ascorbato em fisiologia animal e vegetal, bem como a saúde humana, continuam a ser os temas de científico ativo investigação e controvérsia.

L-ascorbato é um redutor fisiológico e abundante da enzima do cofactor em sistemas de mamíferos, e contribui para numerosas reacções enzimáticas bem definida envolvendo a hidroxilação do colagénio, carnitina e norepinefrina biossíntese, o metabolismo da tirosina e hormona peptídica amidação ^2. Curiosamente, evide montagemdno sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na estimulação de outras dioxigenases dependentes de ferro, tais como os de prolilo e asparaginilo hidroxilases envolvidos na hidroxilação e direccionamento dos factores de hipoxia-inducible (HIFs) 1α e 2α ^3. Um relatório recente sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na maturação de células T através da cromatina que afecta a sua actividade através de desmetilação para estimular as hidroxilases nucleares, proteínas de domínio (JmjC) Jumonji C; o último dos quais parecem exigir ascorbato para a atividade completa ^4. Com efeito, a estimulação de tais enzimas por ascorbato parece ocorrer através de um mecanismo semelhante ao da estimulação por ascorbato de HIF e colagénio hidroxilases. Entre outros efeitos clássicos, ascorbato contribui significativamente para antioxidação celular como uma quebra de cadeia de captador de radicais solúveis em água e ⁵ para a reciclagem de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E), através da redução da α-tocopheroxyl radical ^6, which é importante na proteção contra a peroxidação lipídica da membrana ^7. É importante notar, embora a maioria dos mamíferos é capaz de síntese hepática de novo de ascorbato de D-glicose, primatas superiores, cobaias e alguns morcegos dependem de fontes dietéticas de vitamina ^8. Isto é devido à inactivação do gene GULO, os ortólogos de que em mamíferos não afectadas codificam a enzima, γ-gulono-lactona oxidase ^9-13. Esta enzima é necessária para a reacção final na biossíntese de ascorbato de glicose ^13.

Após a absorção mediada por transportador a partir do lúmen intestinal em seres humanos, o ácido ascórbico é distribuída por todo o corpo, o sistema circulatório. A vitamina é normalmente encontrado em sua forma reduzida em milimolares concentrações intracelular (com a notável exceção dos eritrócitos em que as concentrações são normalmente semelhantes aos da concentração plasmática vigente), e em conc micromolarentrations (por exemplo, 50-200 uM), na maioria dos fluidos extracelulares ^14,15.

Em condições fisiológicas, ascorbato normalmente sofre uma oxidação reversível de um elétron para o radical livre ascorbil (AFR, também conhecido como monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Enquanto o AFR é relativamente estável radical ^16, na ausência da sua rápida redução enzimática de um electrão de volta para o ácido ascórbico, dois AFRs pode promover dismutar para um ascorbato e um desidroascorbato (DHA) ^9,13,17. Dentro do interior da célula, o produto de oxidação de dois electrões do ascorbato, DHA, pode ser rapidamente reduzida para trás pela glutationa-ascorbato e NAD (P) H-enzimática dependente e as reacções não-enzimáticas ^13.

Enquanto ele é classicamente aceito que apenas papel significativo do ascorbato no metabolismo do ferro é estimular a absorção dietética de ferro não-heme ^18, nós e outros forneceram evidências strongly sugerindo que o ácido ascórbico desempenha um papel muito expandida no metabolismo deste metal. Em primeiro lugar, o ácido ascórbico que é liberado por células-ascorbato repleto parece desempenhar um papel importante na modulação da absorção de ferro não ligado à transferrina por células ^19,20, e evidência muito recente indica que o ácido ascórbico também modula a absorção de ferro ligado à transferrina por células ^21, o último dos quais corresponde a um grande fisiológico rota ferro-uptake ^22.

Ascorbato é essencial para a função normal do sistema nervoso central em mamíferos ^23,24. Juntamente com o córtex supra-renal, glândula pituitária, do timo, da retina e do corpo lúteo, o cérebro contém altas concentrações de ascorbato em relação a outros tecidos do corpo ^23,25-27. Além disso, a exposição de ambos os astrócitos ^28,29 e células neuronais semelhante ³⁰ ao glutamato é conhecido por provocar a libertação de ascorbato no espaço extracelular, onde a ascorbate é pensado para ajudar a proteger os neurônios contra a disfunção neuronal induzida pelo glutamato ^31. Embora o mecanismo exato de glutamato induzida por liberação ascorbato de astrócitos é desconhecida, que recentemente forneceu evidências indicando o envolvimento de células inchaço causado pela captação de glutamato pela glutamato astrócitos e transportador de aspartato (GLAST, também conhecido transportador isoforma aminoácido excitatório 1 [EAAT1 ] em humanos) e conseqüente ativação de osmólito e ânions canais sensíveis ao volume (VSOACs) que são permeáveis ​​a pequenos ânions orgânicos, tais como ácido ascórbico ^32. As identidades moleculares das condutas de membrana plasmática envolvidas na formação VSOAC continuam a ser identificadas ^33,34.

Embora muitos ensaios foram desenvolvidos para a determinação de ácido ascórbico em amostras biológicas, que incluem espectrofotométricos, fluorométricos e ensaios cromatográficos ^35,36, existe uma grande variabilidade em especificidade, sensibilidade, interference por contaminantes químicos, faixa linear eficaz e estabilidade do analito endpoint. Além disso, outros factores importantes que influenciam a escolha do ensaio são a rapidez, a facilidade de utilização e acesso a equipamento relativamente especializadas tais como a cromatografia líquida de alto desempenho aparelho (HPLC).

Aqui apresenta-se um ensaio de microplaca colorimétrico simples e altamente específico para a determinação de ácido ascórbico intracelular em células de cultura, assim como um ensaio separado para a determinação de ascorbato-efluxo a partir de células cultivadas. O último ensaio visa contornar o problema da subestimação da liberação ascorbato a partir de células devido ao rápido recaptação de ascorbato liberado pelos transportadores dependentes de ascorbato de sódio (SVCTs). Embora ambos os métodos têm aparecido em algumas de nossas publicações anteriores ^{19,20,32,37,38,} este manuscrito fornece um conjunto explícito de instruções e orientações para a sua execução eficaz.

Protocol

1. Determinar ascorbato intracelular em células cultivadas Cultura de células e colheita Grow suspensão (por exemplo, eritroleucemia humana, K562) ou células aderentes (por exemplo, astrócitos primários) usando procedimentos padrão de cultura 19-21,32,38. Nota: para garantir células contêm ascorbato, carregar células cultivadas com ascorbato quer como ascorbato ou DHA 33,39. Criar um extrato celular contend…

Representative Results

Determinação de ascorbato intracelular em células cultivadas de suspensão No primeiro ensaio (Figura 1), o ácido ascórbico intracelular é determinada, na sequência específicas de ascorbato (isto é, AO-sensível) redução de ferricianeto de ferrocianeto, utilizando a determinação altamente sensível do ferrocianeto de um processo publicado previamente 37. A detecção de ascorbato é baseado na quelação colorimétrico de ferro ferroso que é ge…

Discussion

Neste artigo, apresentamos dois ensaios de microplacas colorimétricos rápidos, específicos e relativamente sensíveis para a determinação de ácido ascórbico derivado dos compartimentos intra e extracelulares em células em cultura. Os ensaios podem ser concluída com acesso a equipamento de laboratório e reagentes. O reagente apenas moderadamente dispendioso necessário para o ensaio é de AO, que é essencial, uma vez que confere um elevado grau de especificidade para o analito L-ascorba…

Materials

Nunc 96-well flat-bottom plates	Thermo	269620	Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge	Eppendorf	5415D	A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge	Eppendorf	5810R	Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer	Bio-Rad		Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)	Eppendorf		This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich		Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer	Sigma-Aldrich	30790	Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B	Sigma-Aldrich	C6762	Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO)	Sigma-Aldrich	A0157	Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC)	Sigma-Aldrich	455989	Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt)	Sigma-Aldrich	92940
Sodium L-glutamate	Sigma-Aldrich
L-glutamine	Sigma-Aldrich
Saponin	Sigma-Aldrich	47036	Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate