Yetişkin Zebra balığı Lateral Hat Rejenerasyon için bir Deneyi
Summary
Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık ziyade embriyo / larva incelenir için, erişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde uygulanabilen bir nicel yan hat rejeneratif deneyi geliştirilmiştir. Deney 1) neuromast ve 2) tek tek saç hücre düzeyde çözünürlüğü dahil.
Abstract
Nedeniyle insanda işitme ve denge bozuklukları, klinik önemi, bu tür Zebra balığı gibi model organizmalar yanal hat geliştirme ve rejenerasyon çalışması için kullanılmıştır. Zebra balığı nedeniyle hızlı gelişimi zaman ve yüksek rejeneratif kapasitesinin bu tür çalışmalar için özellikle çekici. Bugüne kadar, yanal çizgi rejenerasyon Zebrafish çalışmalar esas olarak, çünkü bu aşamada neuromasts alt sayısının embriyonik ve larva evrelerinin balık kullanmıştır. Bu yanal çizgi rejenerasyon ve / veya daha önceki gelişim evrelerinde daha kolay gelişme kantitatif analizini yapmıştır. Nörolojik ve non-nörolojik hastalıkların çok zebra balığı model yetişkin balık olup embriyo / larva incelenir için bir deney kullanılabilir, böylece o akım tatbik edilebilir, yetişkin Zebrafish kantitatif bir yan hat rejeneratif tahlili geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır yetişkin zebrabalıkları hastalık modelleri. Van TRUM tarafından daha önceki çalışmaları üzerine inşap vd. 17. yetişkin Meksika kör mağara balık ve Zebra balığı (Br.rerio) saç hücrelerinin ablasyonu için prosedürleri tarif, bizim tahlil deney ve kontrol grupları arasında nicel bir karşılaştırmasını sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu yanal doğrultusunda belirli bir bölgede saç hücrelerinin gentamisin kaynaklı nekroz izlenerek ve 24 saatlik bir zaman periyodu boyunca neuromast yeniden ortaya çıkma yüzdesi göre bir rejeneratif neuromast standart eğri geliştirerek gerçekleştirildi. Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olan tek tek saç hücre seviyesine analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.
Introduction
Yanal çizgi (LL) sistemi işitme, denge, rheotaxis ve bu tür eğitim ve yırtıcı kaçınma 1-5 olarak aracılık davranışları sorumludur hem de balık ve amfibiler bulunan bir mechanosensory organdır. Bu destek hücreleri ile çevrili saç hücre kümeleri oluşur, her ikisi de neuromasts 6'ya yapılar konumlandırılmıştır. Bu neuromasts tipik olarak balık baş görülen yatay bir dikiş ile gövde ve kuyruk uzunlamasına ekseni boyunca (dikişler adlandırılır) dik çizgiler halinde düzenlenir. Yetişkinde, neuromasts embriyonik ya da larva balık 6 ile karşılaştırıldığında, dikiş içinde sayısında önemli ölçüde daha fazladır. Zebrafish Biyomedikal çalışmalar antibiyotik tedavisi, gürültü kaynaklı travma, kronik enfeksiyon, vb etkisi üzerinde odaklanmıştır. saç hücrelerinin çabasıyla 7,8 daha iyi insanlarda etkilerini anlamak için.
Pek çok omurgalılarda aksine, teBöyle Zebra balığı (Br.rerio) gibi leosts, kayıp saç hücrelerinin yenilenmesine yeteneği var. Zebrafish nedeniyle hızlı bir gelişme süresi ve yüksek rejeneratif kapasitesinin özellikle yararlıdır. Ancak bugüne kadar; yanal hat geliştirme ve / veya rejenerasyon Zebrafish çalışmalar kaynaklanmaktadır kolay sayma ve analiz 6,9,10 sağlayan yanal çizgi neuromasts azaltılmış sayısına embriyonik ve larva balık kullanmıştır.
Ancak, nörolojik ve non-nörolojik hastalıklar 11-16 gibi birçok zebrabalıkları modelleri yetişkin balık değil larva incelenir, biz gentamisini kullanılarak yetişkin zebrabalıkları bir yanal çizgi rejeneratif tahlili (önce Zebra balığı larvaları kullanılan bir aminoglikozid geliştirilmesi üzerinde duruldu ve bir deney kullanılabilir, böylece daha yakın) yetişkin balık 17, kullanılan mevcut yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde de uygulanabilir. Daha önce Van Trump e prosedürleri yayınlandığı süret al. 17 yetişkin balıklarda saç hücre ablasyonu için kurulmuş koşullar, bu kontrol ve bu transgenik çizgiler zebra balığı veya farmakolojik-kaynaklı hastalık durumlarını kullanırken olduğu gibi Deney grupları arasında Kantitatif karşılaştırma için gereklidir neuromast rejenerasyon için bir standart eğri oluşturmak yoktu Zebra balığı 18. Bu nedenle kontrol ve deney grupları karşılaştırırken böyle yetişkin zebrabalıkları hastalık modellerinde olduğu gibi bizim verilerini kullanmak müfettişleri sağlamak için neuromast rejenerasyon standart bir eğri oluşturmak için saç hücre ablasyon için Van Trump ve ark. 17 prosedürleri takip etti, ama onların çalışmaları üzerine inşa . Tahlil, aynı zamanda çözünürlüğü daha yüksek bir düzeyde gerekli olduğunda tek tek saç hücreye analiz uzantısı izin verecek şekilde tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriyonik ve larva zebrabalıkları 8,24,25 lateral hat (LL) rejenerasyon analizi için kurulmuştur edebiyat geniş gövdesine dayanarak, çalışmamızın amacı zebrabalıkları yanal hat rejenerasyon için niceliksel bir test geliştirmek olduğunu olabilir en iyi yetişkin balık incelenir hastalık modelleri uygulanabilir. Biz yetişkin balık embriyonik / larva balık için geliştirilen yöntemler uygulanarak zaman belli kritik noktalarda önemli olduğunu bulundu. Bu noktaların en önemli kabul edi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
