Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique
Summary
Le protocole décrit ici vise à expliquer et abréger les nombreux obstacles sur le chemin de la route complexe menant à nucléosides triphosphates modifiés. Par conséquent, ce protocole facilite à la fois la synthèse de ces éléments constitutifs activés et leur disponibilité pour les applications pratiques.
Abstract
La stratégie traditionnelle pour l'introduction de fonctionnalités chimiques est l'utilisation de la synthèse en phase solide par l'ajout de précurseurs des phosphoramidites modifiés de façon appropriée à la chaîne naissante. Cependant, les conditions utilisées lors de la synthèse et de la restriction de séquences assez courtes entravent l'application de cette méthodologie. D'autre part, des triphosphates de nucléosides modifiés sont activés blocs de construction qui ont été utilisées pour l'introduction douce de nombreux groupes fonctionnels dans des acides nucléiques, une stratégie qui ouvre la voie à l'utilisation d'acides nucléiques modifiés dans une palette large d'applications pratiques tels que l'étiquetage fonctionnel et génération de ribozymes et DNAzymes. L'une des principales difficultés réside dans la complexité de la méthode qui conduit à l'isolement et la caractérisation de ces analogues nucléosidiques.
Dans cet article, vidéo, nous présentons un protocole détaillé pour la synthèse des these analogues modifiés en utilisant des réactifs à base de phosphore-(III). En outre, la procédure pour leur caractérisation biochimique est divulguée, avec un accent particulier sur les réactions d'extension d'amorce et TdT polymérisation de résidus. Ce protocole détaillé sera utile pour l'artisanat de dNTP modifiés et leur utilisation ultérieure en biologie chimique.
Introduction
Triphosphates de nucléosides 5'-((d) PNT) représentent une classe de biomolécules vitaux qui sont impliqués dans d'innombrables processus et les fonctions allant d'être la monnaie universelle de l'énergie aux régulateurs du métabolisme cellulaire. En plus de leur rôle dans ces transformations biologiques fondamentaux, leurs homologues modifiés ont avancé comme une plate-forme souple et doux pour l'introduction de groupes fonctionnels dans des oligonucleotides, une méthodologie qui complète bien la synthèse en phase solide automatisée qui est habituellement appliqué 1,2. En effet, à condition que les (d) PNT peuvent agir en tant que substrats pour ADN et ARN polymérases 3, une multitude de groupes fonctionnels, y compris les acides aminés 4-13, acides boroniques 14,15, 16, nornbornene résidus diamondoïde-17, comme des chaînes latérales pour organocatalyse 18, les acides biliaires, et même des 19 oligonucleotides 20 peut être introduit dans des oligonucleotides.
_content "> Au-delà de ce qui représente un vecteur convenable pour la fonctionnalisation d'acides nucléiques, de dNTP modifiés peuvent être engagés dans SELEX et d'autres méthodes combinatoires connexes de sélection in vitro pour la production d'acides nucléiques catalytiques modifiées 21-30 et les aptamères pour diverses 10 applications pratiques, 31-36. Les chaînes latérales supplémentaires qui sont introduites par la polymérisation des dNTP modifiés sont pensés pour augmenter l'espace chimique qui peut être explorée lors d'une expérience de sélection et de compléter l'arsenal fonctionnel plutôt pauvres d'acides nucléiques 37. Cependant, malgré ces traits attrayants et les progrès récemment accomplis dans le développement de deux méthodes d'analyse et de synthèse, universellement applicable et la procédure à haut rendement existe pour l'artisanat de nucléosides triphosphates modifiés 2,38.L'objectif de ce protocole actuel est de faire la lumière dans la (parfois) des procédures complexes menant to la synthèse et la caractérisation biochimique de ces blocs de construction activées (figure 1B). Une attention particulière sera accordée sur tous les détails synthétiques qui sont souvent difficiles à trouver ou sont absents dans les sections expérimentales mais sont encore crucial pour la réussite de la voie de synthèse conduisant à l'isolement de (d) PNT purs (figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L'inclusion des modifications dans les acides nucléiques de l'intérêt pour de nombreuses applications pratiques, y compris le développement de antisens et antigéniques des agents 42,43, l'étiquetage et le marquage fonctionnelle d'oligonucléotides 41, et dans les efforts visant à élargir l'alphabet génétique 44-46. des altérations chimiques et les groupes fonctionnels sont généralement introduits dans des acides nucléiques par l'application de protoc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse (subventions n ° PZ00P2_126430 / 1 et PZ00P2_144595). Professeur C. Leumann est grandement apprécié pour fournir l'espace et l'équipement de laboratoire, ainsi que pour son soutien constant. Mme Sue Knecht est reconnu pour des discussions fructueuses.
Materials
| tributylammonium pyrophosphate | Sigma Aldrich | P8533 | Hygroscopic solid, keep under Ar |
| 2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one | Sigma Aldrich | 324124 | Moisture sensitive |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 82704 | Under molecular sieves |
| Dioxane | Sigma Aldrich | 296309 | Under molecular sieves |
| dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 40248 | Under molecular sieves |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90342 | |
| Tributylamine | Sigma Aldrich | 90781 | |
| ddH2O | Milli-Q | deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC) | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | 159220 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | DLM-4-25 | |
| Biochemical reagents | |||
| g-[32P]-ATP | Hartmann Analytics | FP-301 | |
| Natural dNTPs | Promega | U1420 | |
| Vent (exo–) DNA polymerase | NEB | M0257S | |
| DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment | NEB | MO210S | |
| 9°Nm DNA polymerase | NEB | MO260S | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Promega | M828A | |
| Pwo DNA polymerase | Peqlab | 01 01 5010 | |
| T4 PNK | Thermo Scientific | EK0032 | |
| Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) | Serva | 10679.01 | |
| Agarose | Apollo Scientific | BIA1177 | |
| G10 Sephadex | Sigma | G10120 | |
| Urea | Apollo Scientific | BIU4110 | |
| Equipment | |||
| Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) | Phenomenex | ||
| Gene Q Thermal Cycler | Bioconcept | BYQ6042E | |
| PCR vials | Bioconcept | 3220-00 | |
| HPLC system | Amersham Pharmacia Biotech | Äkta basic 10/100 | |
| Oligonucleotides | |||
| All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE | |||
| 5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1 | |||
| 5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1 | |||
| 5'-GAATTCGATATCAAG P2 | |||
| More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles: | |||
| Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330 | |||
| Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F. |
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