정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링
Summary
단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.
Abstract
줄기 세포 인구의 이질성은 다른 계통쪽으로 분화 성향으로, 줄기 세포 생물학에 대한 자세한 이해를 방해한다. 단일 세포 사체 분석은 개인차를 해부하기위한 새로운 접근 방식이 될 수 있습니다. 우리는 하나의 셀 QRT-PCR 방법을 개발하고,이 방법은 여러 유전자 발현 프로파일에서 잘 작동하는지 확인했다. 단일 세포 수준에서 OCT4으로 분류되어 각각의 인간 배아 줄기 세포, :: EGFP 양성 세포는 OCT4 높은 표현하지만, NANOG 표현의 다른 수준이 있습니다. 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 인구의 이질성을 심문하는 것이 유용 할 것이다.
Introduction
가장 높은 진핵 생물의 인구가 풀링 인구의 분석에 따라서 이기종 있으며, 그것은 자신의 휴대 전화 기능을 해석하는 것이 어렵습니다. 인구 내의 개별 세포가 미묘하게 다를 수 있습니다, 그리고 이러한 차이는 전체 인구의 1, 2의 속성과 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 섬세 독특한 방법으로 3, 4의 혈통 사양을 능성의 서로 다른 수준의 다양한 잠재력을 일으키는 이기종 것으로 알려져있다. 예를 들어, 다른 세포 표면 항원이 미분화 다 능성 줄기 세포를 분류하기 위해 사용될 수있다, (5) 및 오스틴 스미스 그룹은 그들의 형태, 감별 성향 및 통로 6 시그널링 종속성에 기초하여, 마우스 배아 줄기 세포의 다 능성의 상이한 레벨을 제안 하였다. 이러한 현상은 인간의 배아에 가설 된NIC 줄기 세포 12. 전체적인 연구는 다른 줄기 세포가 아닌 개별 단일 줄기 세포 사이에 수행 된 반면, 잠재적으로 모든 체세포 계통쪽으로 분화 능력에 영향을 단일 세포 수준에서 다 능성의 상이한 레벨을 분석하는 것은 매우 흥미로운 일 수 있었다.
세포 및 분자 이질성은 '단일 세포의 사체'라고하는 전사 프로파일에 의해 결정 및 유전자 발현 수준 8-10 정량화에 대한 새로운 접근 방식을 강조 할 수있다. 각각의 세포에서 유전자 발현 수준의 분석을 위해, 우리는 하나의 셀 정량적 RT-PCR의 간단하지만 강력한 프로토콜을 개발했다. 우리는 최소한의 기술적 변화와 차이의 결과로, 각각의 단일 세포 용 해물의 절반뿐만 아니라 인간 배아 줄기 세포의 희석 한 총 RNA를 비교하여 우리의 프로토콜의 효과와 가능성을 확인했다. 또한, 우리는 동질적인 (P)를 분리하는 유전자 기자 라인을 사용유전자 타겟팅 시스템을 이용하여 인간 배아 줄기 세포의 opulation. OCT4 궤적 (OCT4-2A-EGFP-PGK – 푸로가 구성) 및 TALEN 플라스미드의 한 쌍을 대상으로 대한 기증자 벡터 (11)를 사용 하였다. 기증자 벡터와 TALEN 플라스미드 한 쌍의 우리의 nucleofection 및 클론 선택 프로토콜과 인간 배아 줄기 세포는 우리의 일상적인 프로토콜 12을 기준으로 수행 된 유지 보수를 이용하여 인간 배아 줄기 세포 (H9, WA09)에 소개되었다. 우리는이 유전자 기자 라인 OCT4에 OCT4의 표현 EGFP을 표현 :: EGFP 인간 배아 줄기 세포를 확인했다.
우리의 결과는 (OCT4으로 분류 :: EGFP 강하게 양성 세포) 각각의 인간 배아 줄기 세포는 OCT4 표현의 높은 수준,하지만, NANOG 식의 다른 수준을 유지 것을 보여줍니다. 따라서, 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 다 능성 줄기 세포의 인구 이질성을 연구하는 것이 유용 할 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 세포 유전자 프로파일은 단일 세포의 기능이나 전체 인구를 예측할 수있는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 기술적 인 제한으로 전체 유전자 프로파일 분석은 인구의 평균으로 제한하고있다. 유전자 발현 패턴 및 개별 세포 모집단 사이 수준의 변화는 잘못된 해석을 일으키는 것으로 제안되어왔다. 이러한 다양한 셀룰러 양태는 인간 배아 줄기 세포에서 발견 될 수 있고, 그들의 이질성 능성 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
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