Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR
Summary
Одноместный ген клеток выражение анализ необходим для понимания стволовых клеток неоднородности.
Abstract
Неоднородность популяции стволовых клеток затрудняет детальное понимание биологии стволовых клеток, таких, как их дифференциации склонности к различных линий. Одна ячейка транскриптома анализ может быть новый подход к рассекает индивидуальные различия. Мы разработали метод Single Cell Qrt-PCR, и подтвердил, что этот метод хорошо работает в нескольких профилей экспрессии генов. В уровне одной клетки, каждый человек эмбриональных стволовых клеток, отсортировано по OCT4 :: EGFP-положительные клетки, обладает высокой выражение в OCT4, но другой уровень экспрессии NANOG. Наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезным, чтобы допросить неоднородности населения.
Introduction
Самые высокие популяции эукариот являются гетерогенными, таким образом, с анализом объединенной популяции, часто бывает трудно интерпретировать их клеточных функций. Отдельные клетки внутри популяции может быть немного отличается, и эти различия могут иметь важные последствия для свойства и функции всего населения 1, 2. Тем более, человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), как известно, неоднородны, что вызывает различные уровни плюрипотентности и разнообразные потенциалы в спецификации клонов в деликатно отличительных способов 3, 4. Например, различные антигенов клеточной поверхности могут быть использованы для категоризации недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, 5 и группа Austin Smith предложены различные уровни в плюрипотентности мышиных эмбриональных стволовых клеток, в зависимости от их морфологии, дифференцировки склонности и зависимости от пути передачи сигналов 6. Это явление было предположение, в человеческом эмбрионеNIC стволовые клетки 7. В то время как были выполнены исследования общей среди различных линий стволовых клеток, а не отдельные единичные стволовых клеток, это может быть очень интригующим для анализа различных уровней плюрипотентности на уровне одной клетки, которые потенциально влияет на их дифференциации возможностей в направлении всех соматических клеточных клонов.
Клеточная и молекулярная гетерогенность может быть продиктовано транскрипции профилирования, которая называется «единого транскриптома клеток" и подчеркивает, новые подходы к количественной уровни экспрессии гена 8-10. Для анализа уровня экспрессии гена в отдельных клетках, мы разработали простой, но надежный протокол одного клеток количественного RT-PCR. Мы подтвердили эффективность и целесообразность нашего протокола путем сравнения каждую половину отдельных клеточных лизатов, а также серийно разбавленных тотальную РНК из ЭСК, в результате чего минимальных технических изменений и различий. Кроме того, мы использовали генетический репортер линию, чтобы изолировать однородной рopulation из ЭСК, использующих систему таргетинга генов. Вектор донором для ориентации OCT4 локус (OCT4-2A-EGFP-ПГК-Puro построить) и пару Talen плазмид были использованы 11. Вектор доноров и пара Talen плазмид были введены в ЭСК (Н9, WA09) с помощью нашего nucleofection и клональную протокол выбора и поддержания ЭСК была выполнена на основе нашей повседневной протокола 12. Мы подтвердили этот генетический репортер линия выразить EGFP для выражения OCT4 в OCT4 :: EGFP ЭСК.
Наш результат показывает, что отдельные ЭСК (Начиная с OCT4 :: EGFP сильно положительные клетки) занимают высокие уровни экспрессии OCT4, но разные уровни экспрессии NANOG. Итак, наш единственный ген клеток выражение анализ должен быть полезен для изучения населения неоднородностей плюрипотентных стволовых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одноместный ген клеток профилирование может быть основным инструментом для прогнозирования функциональность одной клетки или все население. Из-за технических ограничений, весь анализ гена профилирование было ограничено средних населенных пунктов. Вариации паттернов экспрессии ген…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Ли за ценные обсуждения по рукописи. Работа в лаборатории Ли была поддержана грантами от Robertson следователь премии Нью-Йорк Фонда стволовых клеток и из Мэриленда Исследования стволовых клеток фонд (TEDCO).
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
References
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
