Nós descrevemos uma técnica para a análise da síntese de RNA global em hipóxia utilizando imagens. Clique química rotulagem de RNA não tenha sido previamente realizada sob hipóxia e permite a visualização de mudanças globais de RNA no nível da célula única. Esta abordagem complementa as técnicas de RNA médios existentes, permitindo a visualização direta das mudanças célula-célula em síntese de RNA global.
A hipoxia ou abaixamento da disponibilidade de oxigénio está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Ao nível molecular, as células iniciam um programa transcricional específico, a fim de montar uma resposta celular adequada e coordenada. A célula possui várias enzimas sensor de oxigênio que necessitam de oxigênio molecular como co-fator para sua atividade. Estes variam de prolil-hidroxilases para demethylases histonas. A maioria dos estudos que analisem a resposta celular a hipóxia são baseados em populações celulares e estudos médios, e, como tal, a análise de células isoladas de células hipóxicas são raramente executado. Aqui nós descrevemos um método de análise da síntese de RNA global ao nível da célula individual em hipóxia usando clique nele kits de imagem RNA em uma estação de trabalho de oxigênio controlada, seguida de análise de microscopia e quantificação. Utilizando as células cancerosas expostas a hipoxia durante diferentes períodos de tempo, o ARN é marcado e medido em cada célula. Esta análise permitea visualização de mudanças temporais e célula-célula em síntese de RNA mundial seguintes estresse hipóxico.
A hipoxia (tensões de oxigênio) ocorre quando o suprimento normal de oxigênio a um tecido é perturbado. Oxigênio ambiental é um nutriente e uma molécula de sinalização, fornecendo pistas importantes para muitos tipos de células. Alterações em oxigénio do meio ambiente são captadas por um grupo de dioxigenases que controlam a actividade de um factor de transcrição essencial da família conhecida como os factores Hypoxia indutíveis (HIFs). Os HIFs são compostos por duas subunidades, α e β. Existem três isoformas conhecidas de HIF-α (1, 2, e 3) e várias variantes de splicing de HIF-1β. HIF-1β é constitutivamente expressa e não regulado por níveis de oxigênio ambientais 1. Os membros da família HIF-α são regulados de forma dinâmica por uma classe de prolil-hidroxilases (PhDs) eo fator de inibição HIF (FIH); ambos os quais necessitam de oxigénio como um co-factor para catalisar a hidroxilação de HIF-α 2,3. Em normóxia os membros da família HIF-α são hidroxiladas e marcou para proteosomal degradação pelo E3-ligase, von Hippel Lindau (BVS). Em hipóxia os doutores e FIH são inativos ou ter uma atividade reduzida. As isoformas de HIF-α fique estabilizada, formam um heterodímero com o HIF-1β, e efectuar a transcrição de genes que proporcionam a resposta celular para o meio ambiente hipóxico (Figura 1A) 4.
As técnicas atuais de análise de RNA se concentrar na quantificação dos valores médios em uma determinada população celular. As células respondem a um estímulo hipóxico pela iniciação da transcrição de uma miríade de genes que lhes permitem adaptar-se ao seu ambiente hostil 5. No entanto, a hipoxia frequentemente existe como um gradiente, e as células em um ambiente hipóxico não estão sujeitas a um estímulo hipóxico uniforme. Nós descrevemos uma implementação dos kits de imagem RNA Click-lo em uma estação de trabalho de oxigênio controlado para examinar a síntese de RNA global ao nível da célula individual em hipóxia.
O kit de imagem de ARN utiliza um umnucleosídeo lkyne-modificado, 5-etinil-uridina (UE) e ligação quimiosselectiva para permitir a detecção da síntese de ARN mundial temporal e espacialmente, em células e tecidos de 6. Resumidamente, as células são tratadas com hipóxia e cultivadas na presença do UE. Em seguida, são fixadas e permeabilizadas e incorporação da UE em RNA nascente é detectado por ligadura quimiosseletiva de UE com um corante contendo azida. Um fluxo de trabalho típico para esta reacção é mostrado na Figura 1B. Utilizou-se o kit de imagem de ARN para examinar a síntese de RNA no nível de célula única, que resultou do tratamento com hipóxia.
A pequena dimensão do tag alcino permite a incorporação eficaz do nucleósido modificado em RNA especificamente. A ligadura quimiosseletiva ou reação 'clique' é altamente eficiente, rápido e específico 7-10. Todos os componentes da reacção são bio-inerte e a reacção não necessita de solventes ou a temperaturas extremas. A reação clique negaa exigência de marcação radioactiva convencional e permite a visualização direta dos resultados desde a saída é luz. Além disso, a molécula de detecção pode facilmente penetrar amostras complexas permitindo a análise multiplex, incluindo anticorpos para a detecção de proteínas de RNA interactivo. Este ensaio de imagiologia RNA é compatível com corantes orgânicos, incluindo Alexa Fluor e fluoresceína (ITCF).
Nós medimos a mudança na síntese de RNA após o tratamento de nossas células utilizando uma implementação do ambiente de microscopia aberto para objetos remotos (OMERO). OMERO é um software de código aberto, disponível em http://openmicroscopy.org/ . Este software microscópio visualização e análise de imagem permite o acesso ea utilização de uma ampla gama de dados biológicos, incluindo a gestão de bases de dados multidimensionais, heterogêneos. A aplicação cliente permite a visualização e análise de dados de imagem biológica complexos 11 remoto;ele foi usado para quantificar as mudanças visuais na síntese de RNA celular global e único. Estes dados e os passos necessários para analisar a nossa experiência de imagem RNA usando esta visualização de imagens de microscópio e software de análise são mostrados abaixo.
Olhamos para alterações na síntese de RNA mundial após o tratamento de osteossarcoma humano (células U2OS) com hipóxia por até 24 horas. Em todas as condições, detectou variação célula-a-célula no nível de produção de ARN. Tempos curtos de exposição hipóxia não resultou em alterações significativas no nível de RNA nascente nas células. No entanto, a exposição a 24 horas de hipoxia resultou em um aumento significativo na quantidade de ARN produzido em células. A maioria das respostas celulares a hipóxia são medidos após períodos prolongados de exposição, tais como 4 a 24 horas. No entanto, alguns mecanismos são postas em prática muito antes, por exemplo; A activação de NF-kB ocorre dentro de 5-15 minutos de exposição a hipoxia 12. Investigando mais curto hipotempos de exposição xia é, portanto, justifica e poderia prejudicar a respostas mais complicadas, como ciclo celular e apoptose.
Nós descrevemos o uso de um kit de imagem RNA para examinar os efeitos da hipóxia sobre a síntese de RNA em células de osteossarcoma (U2OS). Esta técnica é relativamente simples e fornece dados sobre a transcrição global a um nível de uma única célula. Nós modificamos o protocolo convencional para este kit para incorporar rotulagem em uma câmara de hipóxia. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório do uso desta técnica para medir as mudanças na síntese de RNA em hipóxia. O kit de imagem RNA usamos é adequado para a experimentação em hipóxia, uma vez que não necessita de isótopos radioativos e é tecnicamente compatível com as limitações do trabalho em uma estação de trabalho em atmosfera controlada. Os problemas mais comuns com essa fixação eficiente preocupação técnica e rotulagem da amostra. É extremamente importante que o PFA usado para fixar a amostra é fresco e os passos de lavagem que se seguem a reação 'clique' são realizadas como descrito para garantir baixo fundo coloração da amostra. Se background fluorescência torna-se um problema, recomenda-se a lavagem mais uma vez com tampão de lavagem de reacção 1 ml de imagem kit de ARN após o passo 2.7.4.
O kit de imagem ARN mencionado aqui, representa um avanço significativo na tecnologia de imagem de RNA em termos de facilidade de utilização e especificidade e velocidade de reacção. Esta técnica é limitada principalmente por o tempo que leva para rotular a amostra. O kit de imagem RNA requer um período de rotulagem 1 hr que impede a análise de mudanças rápidas no RNA global que seriam normalmente ocorrem dentro deste prazo. É por esta razão o nosso primeiro ponto de tempo é restringido a 1 h e 15 min. A técnica está associada com algumas outras limitações que em grande parte se relacionam com reagente de compatibilidade com outros marcadores fluorescentes, por exemplo, este kit de imagem de ARN não é compatível com a coloração com faloidina.
Todas as abordagens existentes de estudar a síntese de RNA em células são baseadas na incorporação de nucleósidos modificados para aARN nascente e a detecção de rótulos incorporados por diferentes meios. A abordagem pioneiro foi baseado no uso de precursores de RNA marcadas radioactivamente, seguido por detecção com auto-radiografia. Este método conduziu à descoberta de fases do ciclo celular e outros resultados importantes; no entanto, ele tem uma série de desvantagens, como a morosidade dos trabalhos radioatividade, longos tempos de exposição e imagens de baixa resolução de autoradiografia 6. O próximo avanço no campo explorado meios de imunoquímica para eliminar a necessidade de radioactividade. O ARN foi marcado por incorporação de BrU seguido por detecção imunoquímica. No entanto, o anticorpo eficiente ligação exigido desnaturação de ácidos nucleicos para melhorar o acesso ao DNA ou RNA que causou a perda de morfologia celular e danificou os epítopos de muitas proteínas, impedindo a sua mais detecção com anticorpos marcados com fluorescência 13. A introdução da tecnologia "click chemistry" simplificou o passo de detecção e tele procedimento em comparação com auto-radiografia e imunoquímica. A tecnologia baseia-se na azida-alcino Huisgen reacção de cicloadição onde alcino terminal 5-ethyniluridine liga-se com azida de conjugado com o fluoróforo na presença de Cu (I). A reacção é específica, rápida, não necessita de quaisquer passos adicionais, e é facilmente compatível com a detecção imunoquimica de outros constituintes celulares.
Utilizando esta tecnologia de imagem de ARN mostrou que as células que, na mesma população em monocamada, que tem diferentes níveis de síntese de ARN, em resposta a hipoxia. Restringimos nosso experimento para examinar o efeito de apenas a produção de RNA; no entanto, não é de todo possível, com este kit de imagem para realizar o ARN modificados, reacções múltiplas adicionais que permitem uma análise mais complexa de produção de ARN. Por exemplo, a coloração utilizando um anticorpo secundário específico para os marcadores de transcrição activa, tais como os níveis de RNA polimerase II fosforilada ou mesmo componentes da traduçãoMáquinas ção para dar uma indicação da quantidade de RNA presente recém-produzida, que é convertida em proteína são possíveis. Proteínas adicionais, tais como actina, uma proteína que não deve mudar significativamente com a hipoxia, pode ser testado como um controlo adicional. Além disso, diferentes tipos de células pode ser testada, uma vez que é muito provável que diferentes células têm diferentes taxas de síntese de RNA e mesmo diferentes respostas à hipóxia.
O uso deste kit de imagem RNA é bastante simples, desde que os passos são realizados tal como descrito. Etapas críticas do protocolo envolver chapeamento celular, fixação e coloração de células e aquisição de imagem. É importante para a chapa das células na densidade descritos para evitar sobre ou sob a confluência de experimentação que irá afetar significativamente o resultado. Também é importante o uso de fixador fresco, garantindo a melhor "instantâneo" da célula é tomada e tomar cuidado ao lavar as células após coloração para reduzir o background a um nível que seja aceitável para análise eficiente. Finalmente, o método de aquisição de imagem é de vital importância para obter imagens que são de uma qualidade boa o suficiente para posterior análise. Recomendamos a utilização do melhor microscópio de luz disponível para examinar amostras opticamente como o microscópio utilizado neste protocolo que está disponível na maioria dos centros de pesquisa intensivos globalmente.
The authors have nothing to disclose.
JB é um companheiro clínico CRUK, AS é um estudante de PhD Wellcome Trust, o laboratório SR é financiado por uma Bolsa de Investigação CRUK Sênior (C99667/A12918). Este trabalho foi apoiado por dois prêmios Estratégicos Wellcome Trust (097945/B/11/Z e 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
Click-iT assay Kit | Invitrogen | C-10329/C10330 | http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&catKey=601107&filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D | |
pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
Deltavision Core Microscope | Applied Precision | N/A | http://www.appliedprecision.com/ | |
softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
CoolSnap HQ2 CCD Camera | Photometrics | N/A | http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php | |
Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software] | OME | N/A | http://openmicroscopy.org/ | |
SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software] | Systat Software Inc. | N/A | http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php |