Nous décrivons une méthode pour l'analyse de la synthèse d'ARN à une hypoxie globale en utilisant l'imagerie. Cliquez-chimie étiquetage de l'ARN n'a pas déjà été effectuée en vertu de l'hypoxie et permet la visualisation des changements globaux de l'ARN au niveau d'une seule cellule. Cette approche vient compléter les techniques d'ARN moyennes existantes, permettant la visualisation directe des changements de cellule à cellule dans la synthèse globale de l'ARN.
Hypoxie ou l'abaissement de la disponibilité de l'oxygène est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Au niveau moléculaire, les cellules lancer un programme de transcription particulier en vue de préparer une réponse cellulaire appropriée et coordonnée. La cellule possède plusieurs enzymes de capteur d'oxygène qui nécessitent de l'oxygène moléculaire en tant que cofacteur pour leur activité. Ces vont de prolyl-hydroxylase à déméthylases des histones. La majorité des études sur l'analyse de la réponse cellulaire à l'hypoxie sont basées sur des populations cellulaires et des études moyennes, et en tant que telle analyse cellulaire unique de cellules hypoxiques sont rarement effectué. Ici, nous décrivons une méthode d'analyse de la synthèse globale de l'ARN au niveau de la cellule unique en hypoxie en utilisant Click-iT kits de visualisation de l'ARN dans un poste de travail à oxygène contrôlé, suivie d'une analyse par microscopie et la quantification. Utilisation de cellules cancéreuses exposées à une hypoxie pendant des durées différentes, l'ARN est marqué et mesuré dans chaque cellule. Cette analyse permetla visualisation de et de cellule à cellule changements temporels dans la synthèse globale de l'ARN suivantes stress hypoxique.
L'hypoxie (les tensions faibles en oxygène) se produit lorsque l'apport d'oxygène normale à un tissu est perturbé. L'oxygène est à la fois un environnement nutritif et une molécule de signalisation, en fournissant des signaux importants pour de nombreux types cellulaires. Les variations de l'oxygène de l'environnement sont détectées par un groupe de dioxygénases qui contrôlent l'activité d'une famille de facteurs de transcription essentiels connus comme les facteurs inductibles hypoxie (HIF). Les HIF sont composés de deux sous-unités α, et β. Il existe trois isoformes connues de HIF-α (1, 2, et 3) et de multiples variants d'épissage de HIF-1β. HIF-1β est exprimé de façon constitutive et non régulée par les niveaux d'oxygène de l'environnement 1. Les membres de la famille HIF-α sont dynamiquement régies par une classe de prolyl-hydroxylase (doctorat) et le facteur d'inhibition de HIF (FIH); qui exigent tous deux de l'oxygène en tant que co-facteur de catalyser l'hydroxylation de HIF-α 2,3. En normoxie les membres de la famille HIF-α sont hydroxylés et étiquetés pour proteosomal dégradation par le E3-ligase, von Hippel Lindau (VHL). Dans l'hypoxie et les doctorats FIH sont inactifs ou ont une activité réduite. Les isoformes de HIF-α deviennent stabilisé, forment un hétérodimère avec HIF-1β, et effectuer la transcription de gènes qui fournissent la réponse cellulaire à l'environnement hypoxique (Figure 1A) 4.
Les techniques actuelles pour l'analyse de l'ARN sont axés sur la quantification des valeurs moyennées dans une population cellulaire donnée. Les cellules répondent à un stimulus hypoxique en initiant la transcription d'une myriade de gènes qui leur permettent de s'adapter à son environnement hostile 5. Cependant, l'hypoxie existe souvent un gradient, et les cellules dans un environnement hypoxique ne sont pas soumis à un stimulus hypoxique uniforme. Nous décrivons une mise en œuvre des kits d'imagerie de l'ARN Cliquez-iT à un poste de travail de l'oxygène contrôlée à examiner synthèse globale de l'ARN au niveau de la cellule unique en hypoxie.
Le kit d'imagerie utilise un ARN unenucléoside lkyne modifié, 5-éthynyl uridine (UE) et la ligature chimiosélective pour permettre la détection de la synthèse globale de l'ARN temporellement et spatialement dans les cellules et les tissus 6. Brièvement, les cellules sont traitées avec une hypoxie et cultivées en présence de l'UE. Ils sont ensuite fixées et perméabilisées et l'incorporation de l'UE en ARN naissant est détecté par ligature chimiosélective de l'UE avec un colorant contenant azoture. Une procédure typique pour cette réaction est représenté sur la figure 1B. Nous avons utilisé le kit de visualisation de l'ARN pour examiner la synthèse d'ARN au niveau de la cellule unique qui a résulté d'un traitement par l'hypoxie.
La petite taille de l'étiquette alcyne permet une incorporation efficace de la nucléoside modifié en ARN spécifique. La ligature chimiosélective ou clic réaction est très efficace, rapide et spécifique 7-10. Tous les composants de la réaction sont des bio-inerte et la réaction ne nécessite aucun des températures extrêmes ou des solvants. La réaction de clic niel'obligation pour le radiomarquage classique et permet la visualisation directe des résultats puisque la sortie est lumière. En outre, la molécule de détection peut facilement pénétrer dans les échantillons complexes permettant une analyse multiplex comprenant des anticorps pour la détection de protéines d'ARN-interactif. Ce dosage de formation d'image de l'ARN est compatible avec des colorants organiques, y compris Alexa Fluor et de fluorescéine (FITC).
Nous avons mesuré la variation de la synthèse de l'ARN après un traitement de nos cellules en utilisant une implémentation de l'environnement de la microscopie ouvert pour les objets distants (OMERO). OMERO est un logiciel open-source, disponible à http://openmicroscopy.org/ . Ce logiciel microscope de visualisation d'image et d'analyse permet d'accéder à, et l'utilisation d'un large éventail de données biologiques, y compris la gestion de bases de données multidimensionnelles, hétérogènes. L'application client permet la visualisation et l'analyse de données complexes d'image biologique 11 à distance;nous l'avons utilisé pour quantifier les changements visuels dans la synthèse globale et unique de l'ARN cellulaire. Ces données et les étapes nécessaires pour analyser notre expérience d'imagerie de l'ARN à l'aide de ce microscope la visualisation des images et des logiciels d'analyse sont présentés ci-dessous.
Nous avons examiné les changements dans la synthèse globale de l'ARN après le traitement de l'ostéosarcome humain (U2OS) des cellules à l'hypoxie jusqu'à 24 h. Dans toutes les conditions, nous avons détecté une variation de cellule à cellule dans le niveau de production de l'ARN. Courts temps d'exposition à l'hypoxie n'ont pas abouti à des changements importants au niveau de l'ARN naissant dans les cellules. Toutefois, l'exposition à 24 h d'hypoxie a entraîné une augmentation significative de la quantité d'ARN produite dans les cellules. La plupart des réponses cellulaires à l'hypoxie sont mesurées suivant des périodes prolongées d'exposition, tels que les 4 à 24 heures. Cependant, certains mécanismes sont mis en place beaucoup plus tôt, par exemple; L'activation de NF-kB survient dans 5-15 min d'exposition à l'hypoxie 12. Enquête hypo courtexia temps d'exposition est donc justifiée et pourrait porter atteinte à des réponses plus complexes tels que le cycle cellulaire et l'apoptose.
Nous avons décrit notre utilisation d'un kit de visualisation de l'ARN pour examiner les effets de l'hypoxie sur la synthèse d'ARN dans l'ostéosarcome (U2OS) cellules. Cette technique est relativement simple et fournit des données sur la transcription globale à l'échelle de la cellule unique. Nous avons modifié le protocole classique pour ce kit de marquage d'incorporer dans une chambre de l'hypoxie. A notre connaissance, il s'agit du premier rapport de l'utilisation de cette technique pour mesurer les changements dans la synthèse d'ARN dans l'hypoxie. Le kit de visualisation de l'ARN, nous avons utilisé est adapté à l'expérimentation en hypoxie, car il ne nécessite pas d'isotopes radioactifs et est techniquement compatible avec les limites de travail dans un poste de travail sous atmosphère contrôlée. Problèmes communs avec cette technique préoccupation fixation et l'étiquetage de l'échantillon efficace. Il est extrêmement important que le PFA utilisé pour fixer l'échantillon est frais et les étapes de lavage qui suivent la réaction «clic» sont effectuées comme décrit pour assurer une faible coloration de fond de l'échantillon. Si background fluorescence devient un problème, il est recommandé de laver une fois de plus avec un tampon réaction de kit de rinçage 1 ml d'ARN d'imagerie après l'étape 2.7.4.
Le kit de visualisation d'ARN mentionnée ici représente une avancée significative dans la technologie de l'imagerie de l'ARN en termes de facilité d'utilisation et la spécificité et la vitesse de réaction. Cette technique est principalement limitée par le temps qu'il faut pour marquer l'échantillon. Le kit de visualisation de l'ARN nécessite une période de marquage de 1 heure qui empêche l'examen de l'évolution rapide de l'ARN mondial qui généralement se produire dans ce délai. C'est pour cette raison que notre premier point de temps est limitée à 1 h et 15 min. La technique est associée à quelques autres limitations qui se rapportent en grande partie au réactif compatibilité avec d'autres marqueurs fluorescents, par exemple, le kit d'imagerie de l'ARN n'est pas compatible avec la phalloïdine coloration.
Toutes les approches existantes de l'étude de la synthèse d'ARN dans les cellules sont basés sur l'incorporation de nucléosides modifiés dans l'ARN naissant et la détection de marqueurs sont intégrés par des moyens différents. L'approche novatrice a été basée sur l'utilisation de précurseurs d'ARN radiomarqués suivie par détection avec autoradiographie. Cette méthode conduit à une découverte de stades du cycle cellulaire et d'autres résultats importants; Cependant, il a beaucoup d'inconvénients tels que la lourdeur du travail de la radioactivité, longs temps d'exposition et des images de basse résolution de l'autoradiographie 6. La prochaine avance dans le champ exploitée au moyen d'immunochimie à éliminer la nécessité de la radioactivité. L'ARN a été marqué par incorporation d'BrU suivie d'une détection d'immunochimie. Cependant, la liaison de l'anticorps efficace nécessaire dénaturation d'acide nucléique pour améliorer l'accès à de l'ADN ou de l'ARN qui a provoqué la perte de la morphologie des cellules et endommagé les épitopes de nombreuses protéines, en empêchant la poursuite de leur détection par des anticorps marqués par fluorescence 13. L'introduction de la technologie "click chemistry" simplifié l'étape de détection et til procédure par rapport à une autoradiographie et de l'immunochimie. La technologie est basée sur l'azoture-alcyne Huisgen réaction de cycloaddition où alcyne terminal du 5-ethyniluridine se lie avec de l'azoture conjugué avec le fluorophore en présence de Cu (I). La réaction est spécifique, rapide, ne nécessite pas d'étapes supplémentaires, et est difficilement compatible avec la détection immunochimique d'autres constituants cellulaires.
L'utilisation de cette technologie de l'imagerie de l'ARN nous avons montré que les cellules, dans la même population de la monocouche, ont des niveaux différents de la synthèse de l'ARN en réponse à l'hypoxie. Nous avons limité notre expérience pour examiner l'effet de la production de l'ARN uniquement; cependant, il est tout à fait possible avec cette trousse d'imagerie pour effectuer l'ARN modifiés, des réactions multiplex supplémentaires qui permettent une analyse plus complexe de la production de l'ARN. Par exemple, la coloration en utilisant un anticorps secondaire spécifique pour des marqueurs de transcription actif, tels que les niveaux de phosphorylation de l'ARN polymerase II, ou même des composants de la traduction de machines à donner une indication de la quantité de cet ARN nouvellement produite qui est convertie en protéine sont possibles. Des protéines supplémentaires, telles que l'actine, une protéine qui ne devrait pas changer significativement avec l'hypoxie, peuvent être testés en tant que contrôle supplémentaire. En outre, différents types de cellules peuvent être testées, comme il est très probable que les différentes cellules auront différents taux de synthèse d'ARN et même des réponses différentes à l'hypoxie.
L'utilisation de ce kit de visualisation d'ARN est très simple à condition que les étapes sont effectuées de la manière décrite. Les étapes critiques du protocole impliquent le placage des cellules, fixation et coloration des cellules et l'acquisition d'image. Il est important de plaquer les cellules à la densité décrit pour éviter une sur ou sous confluence à l'expérimentation qui affectera de manière significative le résultat. Il est également important d'utiliser du fixateur frais, assurant le meilleur «instantané» de la cellule est pris et à prendre soin lors du lavage des cellules après coloration à réduire le background à un niveau qui est acceptable pour une analyse efficace. Enfin, la méthode de l'acquisition de l'image est d'une importance vitale pour obtenir des images qui sont d'une qualité suffisante pour une analyse ultérieure. Nous vous recommandons d'utiliser le meilleur microscope à lumière disponible pour examiner des échantillons optiquement tels que le microscope utilisé dans ce protocole qui est disponible dans la plupart des centres à forte intensité de recherche à l'échelle mondiale.
The authors have nothing to disclose.
JB est un moniteur clinique CRUK, AS est un étudiant Wellcome Trust PhD, le laboratoire de SR est financé par une bourse de recherche principal CRUK (C99667/A12918). Ce travail a été soutenu par deux prix stratégiques Wellcome Trust (097945/B/11/Z et 095931/Z/11/Z).
U-2 OS Primary Cells | European Collection of Cell Cultures | 92022711 | http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&dosearch=true | |
PBS | Gibco | 14190094 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094 | |
DMEM | Gibco | 41966029 | https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029 | |
FCS | Gibco | 10270106 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106 | |
Penicillin/Streptomycin | Lonza | DE17-603E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx | |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx | |
0.05% Trypsin-EDTA (1%) | Gibco | 25300062 | http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062 | |
Hypoxia Chamber | Ruskinn | InVivo2 300 | http://www.ruskinn.com/products/invivo2300 | |
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pFA | Sigma | 76240 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en®ion=GB | |
Triton X-100 | Sigma | X-100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en®ion=GB | |
10M NaOH | Sigma | 72068 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en®ion=GB | |
37% HCl | VWR | 20252.335 | https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&searchOp=or | |
VectaShield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483 | |
Actinomycin D | Sigma | A9415 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en®ion=GB | |
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softWoRx [Refered to in text as image processing software] | Applied Precision | N/A | http://www.api.com/softworx.asp | |
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