Summary
Gravidez leva a mudanças significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos. Perfil lipídico pode ser obtido através de cromatografia de gás para permitir a identificação e quantificação de ácidos graxos em classes de lipídios individuais entre ratos alimentados com dietas ricas em gordura vários altos e baixos durante a gravidez.
Abstract
Cromatografia em fase gasosa (GC) é um método altamente sensível para identificar e quantificar o teor de ácidos graxos de lipídios a partir de tecidos, células e plasma / soro, produzindo resultados com alta precisão e alta reprodutibilidade. Em estudos metabólicos e nutricionais GC permite a avaliação de alterações nas concentrações de ácidos graxos seguintes intervenções ou durante mudanças no estado fisiológico, como a gravidez. Extracção em fase sólida (SPE) com aminopropilo cartuchos de sílica permite a separação das principais classes de lípidos incluídos triacilgliceróis, fosfolípidos diferentes, e ésteres de colesterol (CE). GC combinada com SPE foi utilizado para analisar as mudanças na composição de ácidos graxos da fração CE nos fígados de ratos virgens e grávidas que tinham sido alimentados várias dietas de alto e baixo teor de gordura. Há efeitos significativos de interação dieta / gravidez sobre o teor de ácido ômega-3 e ômega-6 ácidos graxos do fígado CE, indicando que as fêmeas grávidas têm uma resposta diferente para Manipulat dietéticoíon que é visto entre as mulheres virgens.
Introduction
Cromatografia em fase gasosa (GC) é uma técnica bem estabelecida utilizada para identificar e quantificar a incorporação de ácidos gordos para piscinas lipídicas e das membranas celulares durante 1,2 ou suplementação condições fisiológicas, tais como a obesidade (e doenças relacionadas tais como diabetes) ou gravidez 3 - 5. Também é adequado para a análise dos tipos e quantidades de gorduras em alimentos. Isto é útil na caracterização dietas experimentais, bem como garantir que a indústria de alimentos está em conformidade com os regulamentos. Por exemplo, GC, pode ser utilizado para confirmar a identidade e a quantidade de ácidos gordos num produto, como um suplemento dietético para assegurar que a rotulagem é correcta e regulamentos são respeitados 6,7. Análise de ácidos graxos podem fornecer informações valiosas sobre o metabolismo lipídico na saúde e na doença, o impacto da mudança na dieta, e os efeitos das mudanças no estado fisiológico 8. A utilização de GC para estudar amostras durante a gravidez tem proporcionado importanteinformação sobre alterações no ácido graxo e complexo homeostase lipídica 3.
Antes da separação cromatográfica, os lípidos são tipicamente extraída da amostra, utilizando a solubilidade dos lípidos em misturas de solventes de clorofórmio e metanol. O cloreto de sódio é adicionado a fim de facilitar a separação da mistura de lípidos em solução aquosa e orgânica contendo 9,10 fases. Classes de lípidos complexos de interesse podem ser separados a partir do extracto de lípido total por extracção de fase sólida (SPE). Esta técnica de separação elui classes de lipídios com base em sua polaridade ou afinidade de ligação. Triacyglycerols (TAG) e éster de colesterol (EC) são eluidos primeiro como uma fracção combinada, outras classes, a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), e os ácidos gordos não esterificados (NEFA) são eluídas por aumento da polaridade do solvente de eluição . A separação do TAG da CE explora a ligação da TAG apenas a um cartri SPE frescodge, permitindo CE a ser eluído. TAG pode então ser eluída por aumento da polaridade do solvente de eluição 9,10. Este método permite que várias amostras a serem separados, simultaneamente, com um rendimento mais elevado do que é conseguido com a cromatografia em camada fina, o que significa que relativamente pequenas amostras de tamanho (por exemplo, <100 ul de plasma ou soro, <100 mg de tecido) podem ser analisados 11,12.
CG é uma técnica bem estabelecida primeiro descrita em 1950, e foi sugerido que a fase móvel, em seguida, os sistemas de líquido-líquido pode ser substituído por vapor. Ele foi inicialmente usado para a análise de petróleo, mas rapidamente se expandiu para outras áreas, como análise de aminoácidos e bioquímica lipídica, que ainda é de grande interesse. Avanços na tecnologia e equipamento de GC, como o desenvolvimento de colunas capilares das colunas empacotadas utilizadas anteriormente conduziu a nossas técnicas actuais, em que os ácidos gordos são capazes de serseparadas de forma mais eficiente a baixas temperaturas, resultando em GC sendo rotineiramente utilizado para identificar e quantificar os ácidos gordos numa vasta gama de investigações 13.
GC requer ácidos gordos de ser derivatizados de modo que eles podem tornar-se suficientemente volátil para ser eluída a temperaturas razoáveis sem decomposição térmica. Isto normalmente envolve a substituição de um grupo funcional contendo hidrogénio para formar ésteres, tioésteres ou amidos para análise. Os ésteres metílicos são vulgarmente estudada derivados, os quais são produzidos por metilação. Neste método, as ligações éster em lípidos complexos são hidrolisados para libertar os ácidos gordos livres, que são transmethylated para formar os ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAME). O perfil resultante de FAME, determinada por GC, é referida como a composição de ácidos gordos e podem ser facilmente comparadas entre os diferentes grupos experimentais 9,10. A técnica permite que ambas as proporções de indiácidos gordos e as suas concentrações ual a ser medido.
Em adição à utilização de GC para análise de ácidos gordos em estudos de nutrição e na indústria alimentar, a técnica pode ser utilizada numa vasta gama de campos de análise. Por exemplo, as análises ambientais utilizando GC incluem a medição da contaminação da água por inseticidas e análises do solo medição do teor de clorobenzeno. Em toxicologia, GC também tem sido utilizada para identificar substâncias ilegais na urina e amostras de sangue de indivíduos; um tal de aumentar o rendimento desportivo de 12 e a capacidade de separar misturas complexas de hidrocarbonetos torna esta técnica popular na indústria do petróleo para a análise petroquímica 12.
A gravidez está associada com alterações significativas na composição de ácidos graxos dos tecidos maternos, especificamente no conteúdo de ácidos graxos ômega-3 (n-3) e ômega-6 (n-6) aci graxos poliinsaturadosds (PUFA) 3. No estudo actual, que exemplificam o uso de GC na medição de ácidos gordos, descrevendo a sua utilização na análise da composição de ácido gordo do tecido do fígado de ratos virgens feita grávidas e alimentados com dietas de baixo e alto teor de gordura, com diferentes fontes de petróleo. As dietas experimentais foram fornecidas aqui uma dieta de baixa gordura à base de óleo de soja, uma dieta à base de óleo de soja rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg de gordura total) ou de uma dieta à base de óleo de linhaça rica em gordura (130,9 g Total de gordura / kg dieta), desde há 20 dias. A composição de ácidos gordos e nutrientes completo destas dietas têm sido descritos anteriormente 14. As dietas com óleo de soja são ricas em ácido linoleico (18:2 n-6) e conter algum ácido linolénico-α (18:3 n-3) ao passo que a dieta de óleo de linhaça é rico em ácido linolénico-α. Estas dietas de alta gordura representam diferentes rações de linoléico para α-linolênico (rações de 08:01 e 01:01, respectivamente). O método para o isolamento de classes de lípidos individuais e análise por GC que éll estabelecido e validado, e tem sido publicado anteriormente 10, mas sem a descrição técnica pormenorizada aqui encontrados.
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Protocol
1. Procedimentos com animais
- Todo o trabalho animal deve ser realizado de acordo com o escritório de animais domésticos (Scientific Procedures) Act (1986).
- Acasalar ratos Wistar com idade de 10 semanas de idade, por meio de cruzamento monogâmico, e confirmar a gravidez pelo aparecimento de um tampão vaginal. Grave este como o dia 1 de gestação, e começar a dieta experimental. Para as fêmeas virgens, abrigar cada rato individualmente, e começar a dieta experimental.
- Depois de alimentar as dietas experimentais durante 20 dias eutanásia ratos por asfixia CO 2 seguido por deslocamento cervical.
- Use uma pinça de dissecção e tesouras para expor a cavidade abdominal e extirpar o fígado, cortando os ligamentos, que ligam o fígado ao diafragma, parede anterior do abdômen, estômago e duodeno. Lavar o fígado em PBS e congelar em azoto líquido antes da armazenagem à temperatura de -80 ° C.
2. Preparação de um total de lipídeos Extrato 9
- Adicionar moleculpeneiras ar (para encher 1/10 do recipiente de solvente) a todos os solventes para criar solventes "secos". Realizar todos os trabalhos de solvente dentro de um exaustor.
- Cortar cerca de 100 mg de fígado congeladas e pesar. Coloque o tecido em um tubo em um balde de gelo e adicionar 0,8 ml gelada de NaCl 0,9%. Homogeneizar o tecido.
- Adicionar padrões internos dissolvidos em 1 ml / mg de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo o hidroxitolueno butilado (BHT, 50 mg / l) como anti-oxidante. Para 100 mg de fígado de rato adicionar 100 mg de padrão do CE (Cholesteryl heptadecanoato 17:00) Atenção:. Clorofórmio e BHT são perigosos.
- Adicionar 5,0 ml de clorofórmio seco: metanol (2:1, v / v) contendo BHT (50 mg / L).
- Adicionar 1,0 ml de 1 M NaCl, misturar bem em vórtice até que a mistura parece uniforme. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Centrifugar a 1000 xg por 10 min, baixo freio à temperatura ambiente.
- Colete menorfase de Pasteur de vidro usando uma pipeta, transferir para novo tubo de vidro com tampa de rosca e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
3. A separação de classes lipídicas por extracção de fase sólida (SPE) 10
- Ligar o tanque de SPE com uma bomba de vácuo e coloque aminopropil cartucho de SPE de sílica no tanque.
- Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG rotulados e CE no rack tanque na coluna para coletar primeira fracção.
- Dissolver o extrato de lipídios totais em 1,0 ml de clorofórmio seco e vortex.
- Aplicar a amostra para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer para dentro do tubo por meio de rosca, por gravidade. Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante por vácuo.
- Eluir a fracção TAG e CE-se sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x lavagens de 1,0 ml de clorofórmio seco.
- Quando todo o líquido é removido, secar o TAG e CE fraccionamenton sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro PC rotulado na bandeja de tanque na coluna.
- Eluir a fracção de PC sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 ml de clorofórmio seco: metanol (60:40, v / v) até que todo o líquido é removido da coluna.
- Remover e fracção PC seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Colocar uma nova tampa de rosca do tubo de vidro PE marcado na bandeja do tanque e eluir fracção de PE com a adição de 1,0 ml de metanol seco sob vácuo.
- Remover e fracção de PE seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Coloque novo tubo de vidro com tampa de rosca rotulado NEFA no tabuleiro de tanque e eluir fracção NEFA sob vácuo com a adição de 2 x 1,0 mL de lavagens de clorofórmio seco: metanol: ácido acético glacial. (100:2:2, v / v / v) Cuidado: ácido acético glacial é perigoso.
- Retirar fracção recolhida NEFA e seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Coloque um novo cartucho de SPE aminopropil sílica no tanque SPE e colocar um tubo de vidro com tampa de rosca na bandeja do tanque sob o cartucho para coletar resíduos.
- Lavar a coluna com 3 lavagens de hexano seco sob vácuo e, em seguida, uma lavagem de 1,0 ml final, sob acção da gravidade. Não permita que o cartucho se torne seca (transformar os canais de colunas cartucho para uma posição fechada quando o nível de hexano fica perto da matriz cartucho) Cuidado:. Hexano é perigosa.
- Substitua o tubo de resíduos com tubo de vidro novo tampa de rosca rotulado CE.
- Dissolve-se o TAG e CE fracção seca (preparado no passo 3.6) em 1,0 ml de hexano seco e de vórtice. Aplicar esta para a coluna utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravity.
- Quando não mais pinga cair, remova o líquido restante sob vácuo.
- Sob vácuo, lava-se a coluna com 2 x 1,0 mL de lavagens de hexano e seco para eluir CE fracção recolhida e seca sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
- Coloque a nova tampa de rosca tubo de vidro TAG marcados na bandeja do tanque e elute TAG com a adição de 2 x 1,0 ml lavagens de hexano seco: metanol: acetato de etilo (100:5:5) sob vácuo.
- Fracção recolhida a seco sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Acetato de etilo é perigoso.
4. Preparação de FAME do CE 10
- Adicionar 0,5 ml de tolueno seco à fracção CE separado (recolhido no passo 3.19) e vórtice Cuidado:. Tolueno é perigoso.
- Preparação do reagente de metilação (metanol seco, com 2% (v/ V) de H 2 SO 4), de que é necessário 1,0 ml por amostra. Dispensar volume de metanol seco em recipiente de vidro ou de plástico adequado com a tampa e adicionar a quantidade necessária de H 2 SO 4, gota a gota, em seguida, misturar por inversão Cuidado:. Ácido sulfúrico é perigoso.
- Adicionar 1,0 ml de reagente de metilação para as amostras dissolvidas em tolueno seco, a tampa de forma segura os tubos, e agitar suavemente.
- Aquecer as amostras durante 2 horas a 50 ° C.
- Após 2 horas retirar os tubos de calor. Uma vez que adicionar fresco 1,0 ml (0,25 M KHCO3 0.5MK 2 CO 3) Cuidado neutralizantes:. Bicarbonato de potássio e carbonato de potássio são perigosos.
- Adicionar 1,0 ml de hexano seco e de vórtice.
- Centrifugar a 250 xg por 2 min, baixo freio à temperatura ambiente.
- Recolhe fase superior, que contém a FAME, e transferir para um novo tubo de tampa de rosca não vidro descartável.
- Seque o FAME coletados sobazoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana.
5. Remoção de colesterol livre de contaminação de FAME CE 14
(Colesterol livre pode contaminar a amostra, ver Figura 1 para traços exemplo cromatógrafo com e sem a remoção do colesterol livre).
- Coloque um tubo de resíduos dentro do tanque de SPE e colocar um cartucho de SPE de sílica gel para o tanque.
- Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano seco sob vácuo e 1 x 1 ml sob gravidade.
- Remover lavagens de resíduos e adicionar novo tubo de resíduos dentro do tanque.
- Dissolver FAME CE em 1 ml de hexano seco, vórtice.
- Aplicam-se à coluna, utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro e deixa-se escorrer através sob gravidade.
- Lavar coluna com 3 x 1 mL lavagens de hexano sob vácuo.
- Remover lavagens de resíduos e coloque novo tubo não tampa de rosca em tanque rotulado FAME CE.
- Eluir aFAME CE com 2 x 1 ml de hexano seco: éter dietílico (95:5 v / v) lavagens.
- Seca-se sob azoto a 40 ° C. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, por cima de uma semana Cuidado:. Éter dietílico é perigoso.
6. Transferência de FAME em GC Auto Sampler Vial
- Adicionar 75 mL de hexano seco para provar, vortex, e transferir para um frasco de amostra auto GC.
- Adicionar mais 75 mL de hexano seco para provar, vórtice e transferir para a mesma amostra GC auto frasco. As amostras podem ser tapados e armazenados a -20 ° C, nesta fase, até um mês.
7. Análise Usando o cromatógrafo a gás 14
- Analisar FAME em um cromatógrafo a gás. Exemplo configurar: 30 mx 0,25 mM x 0,25 milímetros BPX-70 fundido coluna capilar de sílica com o protocolo de temperatura:
Temperatura inicial de 115 ° C, manter 2 min, rampa de 10 ° C / min até 200 ° C, manter 18,5 min, rampa de 60 ° C / min até 245 ° C, hvelho 4 min.
Coluna: gás hélio, vazão de 1,0, pressão de 14,6 e velocidade 29.
Injector: Temperatura = 300 ° C.
Detector: fluxo de hidrogênio 40,0, ar fluir 184,0, compõem Hélio Gás, Flow 45,0, temperatura = 300 ° C. - Definir taxa de divisão conforme o caso (por exemplo, 25:1 para análise FAME CE).
- Para determinar a área sob cada pico, utilizando software apropriado e identificar FAME por comparação com padrões. Veja a Figura 2, por exemplo, cromatogramas.
- Usar a área sob os picos de dados para calcular a contribuição de ácidos gordos individuais, como uma percentagem do total de ácidos gordos.
- Calcular as concentrações absolutas dos ácidos gordos através da divisão da área do padrão interno pela quantidade adicionada. Dividir a área de cada um dos ácidos gordos por este resultado para obter concentrações absolutas de cada ácido gordo no interior do volume de tecido utilizado.
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Representative Results
O sucesso deste método depende da sequência do protocolo de forma precisa e em utilizar solventes e reagentes de limpeza, a fim de reduzir o "ruído" e contaminação que podem aparecer em um cromatograma. Amostras contaminadas são mais difíceis de analisar, diminuindo a precisão da área sob a curva de cálculos. Se o protocolo é seguido com sucesso um cromatograma com claras simétricas, picos bem definidos e com um mínimo de ruído de fundo deve ser obtido tal como ilustrado na Figura 3. Se a contaminação ocorreu o cromatograma vai mostrar picos adicionais e apresentam não simétricas (inclinadas) picos, tal como ilustrado na Figura 4. Contaminação do colesterol livre irá ocorrer durante a execução de FAME derivado de CE (ver Figura 1, a não ser que o colesterol é removido (tal como descrito no Protocolo 5).
A utilização de uma mistura de calibração preparada permite a identificação do FAME em the amostra. A mistura de calibração é executado utilizando as mesmas configurações de instrumentos como as amostras de modo que o cromatograma pode ser comparada com a amostra e os picos correctamente identificados com base nos seus tempos de retenção, tal como ilustrado na Figura 2.
Área do pico é utilizado para calcular a percentagem de ácidos gordos específicos no total. Uma vez que os dados foram recolhidos, é útil para verificar se apresentam valores extremos, como mostrado na Figura 5. Outlier amostras podem então ser investigados e a extracção e / ou de análise repetida se necessário.
A adição de um padrão interno de amostras (tal como descrito no protocolo de passo 2.3) permite a quantificação de ácidos gordos na amostra por meio de cálculos que utilizam a área da quantidade conhecida do pico do padrão interno em relação à área do pico de interesse, e ajustada para o originais volume da amostra ou peso. Na Tabela 1, FAME dentro de fígado de rato CE são descritos como umpor cento dos ácidos gordos totais (g de ácido gordo total g/100) dentro do fígado CE. Esses dados descrevem os ácidos graxos CE no fígado de ratos virgens ou grávidas alimentados durante 20 dias em uma das três dietas diferentes. A análise estatística usando ANOVA de dois fatores (fatores: dieta, grávida vs virgem) revela efeitos significativos da dieta e gravidez sobre a proporção de vários ácidos graxos, bem como dieta x interações significativas da gravidez (Tabela 1). A título de ilustração, a Figura 6 mostra que o ácido araquidônico (AA; 20:4 n-6), o conteúdo do CE fígado em ratas grávidas está mais influenciado pela dieta do que o de fêmeas virgens.
Figura 1. Cromatogramas comparativos de amostras idênticas, ilustrando a importância da remoção de colesterol livre no tecido do fígado de ratos. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Exemplo do método utilizado para identificar amostras FAME EC a partir de tecido de fígado de rato usando uma mistura de calibração preparados. Um prmistura de calibração epared é executado utilizando as mesmas definições como as amostras do instrumento de modo que os cromatogramas podem ser comparadas para identificar os ácidos gordos na amostra. O cromatograma de acompanhamento para o mix de calibração permite que o FAME no mix de ser rotulados. Este traço marcado pode então ser comparado com o cromatograma da amostra onde grandes picos facilmente identificáveis pode ser comparado pelos seus tempos de retenção com os da mistura de calibração, em seguida, marcada apropriadamente. Por exemplo destacado no traçado. 16:00 é para ilustrar a comparação dos tempos de retenção da mistura de calibração acima para os ácidos graxos no rastreamento exemplo abaixo permitindo a rotulagem correta dos ácidos graxos. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. Exemplo de um cromatograma NEFA contaminado obtido a partir de plasma humano. Existem muitos picos inesperados, como circulados no início da amostra, o que pode afectar a integração dos picos genuínos. Os picos são interrompidos e indefinido como pode ser visto towar ds a extremidade da amostra e tornaram-se inclinada quanto circulado. Isso vai afetar a precisão da área sob a curva de cálculos e da quantificação desses ácidos graxos. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 5. Identificação de dados discrepantes entre a composição de ácidos gordos de CE fígado em ratos alimentados com uma dieta virgens de óleo de soja de alto teor de gordura (n = 6). Isto ilustra como os dados percentuais de ácidos gordos analisados podem ser usados para determinar os resultados ambíguos. Estes dados indicam que a amostra 125 pode ser um outlier, e requer uma investigação mais aprofundada. As cinco principais ácidos gordos dentro do CE (16:00, 18:00, 18:1 n-9 e 18:2 n-6, 20:4 n-6) não são mostrados."Target =". Jpg _blank "> Clique aqui para ver a imagem maior.
Figura 6. Teor de ácido araquidônico de fígado CE entre ratas virgens e grávidas alimentadas com dietas experimentais. Os valores são médias ± SD, n = 6. Significa, sem uma carta comum diferem, P <0,05. * Diferente de fêmeas virgens no grupo da dieta combinada, P <0,05. Esta é uma representação visual dos resultados do Quadro 1 mostram as diferenças no conteúdo de CE de fígado de ratos alimentados com diferentes dietas virgens em comparação com ratos alimentados com as mesmas grávidas dietas. As diferenças podem ser vistas em cada grupo alimentar entre as ratas virgens e grávidas. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Tabela 1. Composição de ácidos graxos de fígado de rato ésteres de colesterol de ratos virgens e grávidas alimentadas com dietas experimentais. Os valores são médias (DP), n = 6. ND indica não detectado (média <0,1%). Significa, sem uma carta comum dentro fêmeas virgens ou grávidas diferem, P <0,05. * Diferente de fêmeas virgens no grupo da dieta combinada, P <0,05. Esta tabela mostra os valores médios de n-3 e n-6 ácidos graxos presentes no tecido do fígado de ratos virgens e grávidas dietas de baixa e variados ricos em gordura quando alimentados. Os resultados foram analisados estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) com nível de significância de P <0,05 para diferenças entre ratas virgens e grávidas, o tipo de dieta e interação dieta x gravidez. Resultados da ANOVA sugerem que há diferenças significativas nos níveis de ácido araquidônico (20:4 n-6) entre virgem e ratas grávidas dentro de mgrupos alimentares atched.
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Discussion
A cromatografia gasosa é uma técnica precisa de usar para análise de ácidos graxos, e sua alta reprodutibilidade considere esta técnica adequada para análises clínicas. Colunas GC apropriadas deve ser utilizado para permitir a identificação dos ácidos graxos de interesse, com colunas disponíveis tendo variações na polaridade da fase estacionária, o comprimento da coluna e do diâmetro interno. A utilização de uma coluna capilar de sílica fundida no presente método de análise proporciona uma boa estabilidade térmica e alta reprodutibilidade de tempos de retenção, devido à sua elevada inércia da superfície e uma boa resolução 8.
As etapas críticas dentro deste protocolo incluem inferior e etapas de coleta de fase superior (protocolo passos 2.7 e 4.8). É importante que tanto a fase correcta é recolhido quanto possível, sem contaminação com qualquer da fase indesejados. A presença de contaminantes de uma amostra vai resultar em uma saída indesejável cromatográfica, Como ilustrado na Figura 2. Ao recolher CE durante SPE é imperativo que as colunas de cartuchos são mantidos saturado com solvente (passo 3.15) seguindo as lavagens com hexano para assegurar a amostra penetra a coluna para permitir a separação bem sucedida de CE da TAG. A separação adicional da EC para remover o colesterol livre é importante para evitar a contaminação de vestígios cromatógrafo aparecendo como ilustrado na Figura 1. É também importante assegurar que requerem passos de remoção de líquido sob vácuo são seguidos precisamente para que todo o líquido seja completamente removido da coluna para assegurar um bom rendimento.
A principal limitação da GC é que os lípidos complexos tais como fosfolípidos e triacyglycerols precisa ser saponificado antes de derivatização para formar FAME antes da análise, de modo que a informação sobre as estruturas específicas destes lípidos e combinações típicas de ácidos gordos é perdido 10. Todas as etapaseste protocolo deve ser levada a cabo numa chaminé de fumos devido ao uso de solventes, o que limita a adequação de um ambiente presente método pode ser realizado dentro Este método também pode ser demorada para a análise de um pequeno número de amostras, tipicamente tendo dois dias de trabalho para começar a partir de amostra de interesse para a saída de dados, a menos que os procedimentos totalmente automatizados são usados. No entanto, quando o processamento de um número maior de amostras, cada uma das fases pode ser feito em lotes para maximizar a eficácia da presente técnica de tempo e disponibilidade de equipamento para outros utilizadores. Certas técnicas no âmbito do protocolo exige prática e destreza manual tais como extracções da fase superior e inferior (os passos 2.7 e 4.8), o qual pode ser um problema para as pessoas com articulações problemáticos ou que são propensos a efeitos negativos de movimentos repetitivos.
Passos dentro deste método pode ser facilmente adicionado ou removido para facilitar a recolha de fracções diferentes para uma vasta gama de amostrass, por exemplo, recolha de PE pode não ser necessário, quando da análise do plasma, mas é de interesse em amostras de tecidos e de células 10. Este método também pode ser modificada para a análise de células de extractos totais de lípidos, onde os passos de SPE podem ser omitidos se desejado. Uma tal variação é que a descrita para os glóbulos vermelhos, que omite o passo de extracção total de lípidos, bem como as etapas 15 de SPE. Em contraste com o protocolo actual, o método utilizado no presente estudo que utiliza 250 ul de um reagente metilante (14% de boro trifluoreto), o qual é adicionado directamente às células vermelhas, juntamente com 250 mL de hexano e aqueceu-se durante 10 minutos a 100 ˚ C. A fase de neutralização é omitido e, em vez de água e hexano, são adicionados, a amostra é então centrifugada e a fase de hexano superior recolhido e transferido directamente para um frasco de auto-amostrador GC sem secagem sob azoto e re-dissolução em hexano.
CG é um método versátil e proporciona reliable resultados com uma variedade de modificações disponíveis 15 e pode ser utilizado para analisar uma ampla variedade de amostras. Isso tem vantagens sobre a espectrometria de massa (MS) quando se analisa o metabolismo do ácido n-6 e n-3 fatty como é capaz de distinguir entre ácidos gordos estruturalmente semelhantes, uma vez que utiliza o tempo de retenção para a rotulagem em oposição a massa atómica. MS é capaz de identificar os ácidos gordos dentro de uma amostra, mas incapaz de distinguir as posições de ligação dupla em estereoisómeros e, portanto, incapaz de dizer certos ácidos gordos para além. Se necessário, ambos os métodos podem ser usados em conjunto por GC-MS 16. Esta técnica é utilizada no decurso da investigação em metabolismo e função no campo de lipidómica lipídica. O uso de GC em conjunto com o MS tem levado a grandes avanços, uma vez que permite a manipulação de identificação de ácidos graxos pelo uso de diferentes fases estacionárias em GC para discriminar entre os ácidos gordos que só MS não pode. GC também pode ser utilizado em combinação com a espectrometria de massa de impacto de electrões(EI-MS), o que permite a identificação de ácidos gordos, quando eles são combinados com derivados químicos alternativos, tais como os ésteres de picolinilo. Isso amplia o uso da técnica e continua a melhorar o perfil lipídico como método de pesquisa em diversas áreas como a fisiologia, a detecção de biomarcadores clínicos e patológicos, bem como a bioquímica lipídico 17.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a contribuição de Meritxell Romeu-Nadal para o estudo ratos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
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